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		農(nóng)桿菌菌株以及農(nóng)桿菌敏感的大豆基因型

　　基因槍轉(zhuǎn)化法也存在一些缺點(diǎn)，另一方面。如外源T-DNA 插入拷貝數(shù)較高、結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，經(jīng)常造成外源基因緘默以及目標(biāo)性狀遺傳不穩(wěn)定等問(wèn)題，因而在一定水平上限制了該方法在轉(zhuǎn)基因研究中的廣泛應(yīng)用。不過(guò)，最近有報(bào)道表明，減少包裹金粉的DNA 數(shù)量可以有效降低T-DNA 插入拷貝數(shù)。另外，利用基因槍轉(zhuǎn)化大豆未成熟子葉的周期一般較長(zhǎng)(一般大于6個(gè)月)也容易造成轉(zhuǎn)化再生植株出現(xiàn)體細(xì)胞變異以及后代不育等問(wèn)題。

　　其獨(dú)特之處在于能夠借助于致瘤Ti質(zhì)粒編碼的Vi蛋白將T-DNA 導(dǎo)入植物細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)在基因組中的整合。自1983年首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株以來(lái)，土壤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefacien被認(rèn)為是雙子葉植物的天然宿主。目前已獲得的200多種轉(zhuǎn)基因植物中，大約85%均來(lái)自于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，該方法已成為植物遺傳轉(zhuǎn)化的首選方法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的過(guò)程主要包括幾個(gè)步驟：農(nóng)桿菌積聚、vir基因的誘導(dǎo)表達(dá)、T-DNA 復(fù)合物的形成、T-DNA 轉(zhuǎn)入并整合到植物基因組。其中，農(nóng)桿菌積聚、vir基因的活化等過(guò)程受植物受傷后產(chǎn)生的酚類(lèi)物質(zhì)如乙酰丁香AcetosyringonAS和羧基乙酰丁香酮的誘導(dǎo)。農(nóng)桿菌的趨化特性以及與植物之間的特異性互作在很大水平上決定了農(nóng)桿菌適宜轉(zhuǎn)化植物及基因型的范圍。盡管外植體損傷可以誘導(dǎo)AS等酚類(lèi)物質(zhì)的發(fā)生，但是對(duì)于大部分大豆基因型來(lái)說(shuō)，損傷誘導(dǎo)發(fā)生的酚類(lèi)物質(zhì)并缺乏以誘導(dǎo)農(nóng)桿菌vir基因的活化。通過(guò)在共培養(yǎng)基中加入適合濃度的酚類(lèi)物質(zhì)如AS可以有效促進(jìn)農(nóng)桿菌積聚和附著以及T-DNA 復(fù)合物的加工和轉(zhuǎn)移。AS使用也是農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化獲得勝利的重要因素之一。由于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化涉及農(nóng)桿菌與大豆外植體之間的互作，因而篩選對(duì)大豆等豆科植物毒性較強(qiáng)的農(nóng)桿菌菌株以及對(duì)農(nóng)桿菌敏感的大豆基因型或外植體可以有效提高大豆轉(zhuǎn)化效率。如Yukaea等發(fā)現(xiàn)，由野生型農(nóng)桿菌KA T23改造而來(lái)的Soy2菌株轉(zhuǎn)化效率比EHA l05提高了2倍以上；而由野生型農(nóng)桿菌Chry5改造而來(lái)的農(nóng)桿菌菌株KYRT1轉(zhuǎn)化效率也顯著優(yōu)于EHA 105和LBA 4404另外，通過(guò)在共培養(yǎng)基中添加適合濃度的抗氧化劑，降低大豆外植體對(duì)農(nóng)桿菌的防衛(wèi)反應(yīng)，減少外植體的褐化反應(yīng)和壞死，也可以有效提高大豆轉(zhuǎn)化效率。此外，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)，輔助以適當(dāng)強(qiáng)度的超聲波處理，也可以有效提高大豆未幼稚胚和子葉節(jié)的轉(zhuǎn)化效率。最近有報(bào)道表明，農(nóng)桿菌侵染階段進(jìn)行真空或低鹽處置也可以促進(jìn)大豆轉(zhuǎn)化效率的提高。

　　農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法具有多方面的優(yōu)勢(shì)。一是可選用的外植體類(lèi)型廣泛。迄今為止，與其它大豆轉(zhuǎn)化方法相比。許多研究者對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的各種不同外植體類(lèi)型如子葉節(jié)、未成熟胚、胚尖、胚軸、半種子、初生葉、花序等轉(zhuǎn)化進(jìn)行了研究，并成功獲得了轉(zhuǎn)基因大豆植株。不過(guò)由于不同外植體類(lèi)型對(duì)農(nóng)桿菌敏感性及再生效率不同，其轉(zhuǎn)化效率也存在明顯差別。如大豆半種子轉(zhuǎn)化效率(3.8%要顯著高于子葉節(jié)轉(zhuǎn)化效率(1.5%農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是T-DNA 插入拷貝數(shù)低，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，外源基因發(fā)生緘默的比例較低。Olhoft等對(duì)270個(gè)T0代大豆獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件中T-DNA 插入結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)基因大豆植株中，T-DNA 插入拷貝數(shù)為12個(gè)的比例約為79.1%其中單拷貝插入比例為31.5%而拷貝數(shù)在3個(gè)以上的比例僅為12.5%不過(guò)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法也存在易發(fā)生嵌合體等方面的問(wèn)題。就目前已有的報(bào)道和作者所在實(shí)驗(yàn)室研究的結(jié)果(未發(fā)表)來(lái)看，利用子葉節(jié)、半種子、胚尖為外植體獲得的轉(zhuǎn)基因大豆植株都有可能發(fā)生嵌合體，特別是共培養(yǎng)基中加入抗氧化劑類(lèi)化合物(如L-cysteinL-cy時(shí)，發(fā)生嵌合體的比例可能會(huì)更高。另外，為了進(jìn)一步加快大豆功能基因組學(xué)的研究，特別是與大豆根發(fā)育及與根瘤固氮相關(guān)基因的研究，近年來(lái)也發(fā)展了利用毛根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogen進(jìn)行大豆遺傳轉(zhuǎn)化的方法。不過(guò)由于外源基因主要是不定根中表達(dá)，不能夠穩(wěn)定遺傳到后代。因此，目前該方法在大豆轉(zhuǎn)基因遺傳改良研究中尚沒(méi)有應(yīng)用。

　　將包裹在金粉或其它惰性金屬資料上的DNA 分子導(dǎo)入植物細(xì)胞，基因槍轉(zhuǎn)化法主要是通過(guò)物理介導(dǎo)的方法。并實(shí)現(xiàn)在植物基因組中的整合。目前基因槍轉(zhuǎn)化法采用的外植體主要是由大豆未幼稚子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生的體細(xì)胞團(tuán)，此外也有利用大豆芽分生組織和胚尖作為外植體進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化的報(bào)道。1988年McCabe等首次利用基因槍法轉(zhuǎn)化大豆芽分生組織，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。1991年finer等利用基因槍法轉(zhuǎn)化大豆懸浮體細(xì)胞團(tuán)并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。1996年Stewart等利用該方法將抗蟲(chóng)基因crylA c導(dǎo)入大豆并獲得了抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因大豆植株。同年，Hadi等利用基因槍法將12個(gè)基因同時(shí)導(dǎo)入大豆體細(xì)胞團(tuán)，并獲得了轉(zhuǎn)基因大豆植株。此基礎(chǔ)上，Santarem等，Ponppa等和Khalafalla等進(jìn)一步研究了影響基因槍轉(zhuǎn)化效率的因素，并對(duì)基因槍轉(zhuǎn)化法進(jìn)行優(yōu)化。2000年Aragäo等以大豆胚尖為外植體，利用基因槍轉(zhuǎn)化法獲得了轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化效率達(dá)20.1%由于不存在與微生物之間的互作，影響大豆基因槍轉(zhuǎn)化效率的因素可能主要與外植體狀態(tài)、轟擊參數(shù)以及轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生率有關(guān)。如Hazel等發(fā)現(xiàn)短時(shí)間培養(yǎng)(<6個(gè)月)大豆懸浮體細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)化效率極低，而培養(yǎng)6個(gè)月后的轉(zhuǎn)化效率則明顯提高。王曉春等發(fā)現(xiàn)利用基因槍轟擊球形期體細(xì)胞團(tuán)時(shí)，其轉(zhuǎn)化效率(8.0%要顯著高于發(fā)育晚期的體細(xì)胞胚(0另外，基因槍轉(zhuǎn)化前將體細(xì)胞團(tuán)置于高滲培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h以上(或自然失水處理)后，可以有效提高大豆轉(zhuǎn)化效率。關(guān)于高滲處置提高轉(zhuǎn)化效率的具體機(jī)制目前還不清楚，一個(gè)可能的解釋是由于高滲處理降低了體細(xì)胞胚的膨壓，利于包裹外源DNA 金粉的進(jìn)入或是減少了金粉對(duì)細(xì)胞破壞的緣故。

　　基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)是不受大豆基因型限制，與農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法相比。多數(shù)栽培品種均可以通過(guò)該方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，且操作方法較為簡(jiǎn)單。另外，基因槍轉(zhuǎn)化法可以同時(shí)將多個(gè)質(zhì)?；蚰康腄NA 片段導(dǎo)入植物基因組，且不需要復(fù)雜的載體構(gòu)建過(guò)程和選用不同的篩選標(biāo)志基因。Hadi等利用基因槍法將12個(gè)質(zhì)粒同時(shí)導(dǎo)入大豆懸浮體細(xì)胞團(tuán)，獲得了攜帶多個(gè)外源基因的轉(zhuǎn)基因大豆植株。此外，基因槍轉(zhuǎn)化法也可以將外源基因直接導(dǎo)入到細(xì)胞器基因組中。這一點(diǎn)與農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化明顯不同，由于在葉綠體膜上沒(méi)有T-DNA 復(fù)合物可以識(shí)別的靶蛋白(如importin類(lèi)蛋白)T-DNA 不能進(jìn)入葉綠體中并和葉綠體基因組發(fā)生同源重組。Dufourmantel等首次利用基因槍法獲得了同質(zhì)化的葉綠體轉(zhuǎn)基因大豆植株。2005年他又獲得了高水平表達(dá)抗蟲(chóng)蛋白CrylA b同質(zhì)化葉綠體轉(zhuǎn)基因大豆植棟。由于葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)(如外源蛋白的高水平表達(dá)、環(huán)境平安等)基因槍法也為葉綠體轉(zhuǎn)基因大豆新品種培育提供一個(gè)新的技術(shù)途徑。

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