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		HTS熒光法應(yīng)用波前編碼顯微鏡限制

　　中間圖像的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的misfocus在寬范圍內(nèi)是不變的，相同的信號(hào)處理，可以應(yīng)用到所有的中間圖像。該處理步驟包括一次性（非迭代）與中間圖像的數(shù)字濾波器的卷積。在Pentium III級(jí)計(jì)算機(jī)，它需要不到100毫秒的時(shí)間來處理1280×1024像素的中間圖像。有了這樣的加工時(shí)間短，波前編碼提供了另一種無法提供的圖像去模糊技術(shù)，使用512×512的圖像需要幾分鐘到幾小時(shí)完成迭代算法。

　　一個(gè)成像系統(tǒng)的校準(zhǔn)過程，生成一個(gè)過濾器，用于與特定的光學(xué)配置的內(nèi)核。在顯微鏡系統(tǒng)中，過濾器的內(nèi)核是由光學(xué)系統(tǒng)的形狀，特定目標(biāo)類型和放大倍率，中間繼電器倍率，和檢測(cè)器的像素間距。一旦與目標(biāo)光學(xué)配置的成像系統(tǒng)被校準(zhǔn)后，過濾器內(nèi)核溶液可以被用于所有平臺(tái)上與此相同的結(jié)構(gòu)。確定過濾器的內(nèi)核開始收購(gòu)多家PSF圖像，并將其提交到專有軟件，它落戶在一個(gè)過濾器的內(nèi)核，讓最優(yōu)質(zhì)的過濾圖像。

　　有幾種方法可以納入到圖像處理路徑的處理算法。CDM Optics公司（科羅拉多州博爾德）開發(fā)的動(dòng)態(tài)鏈接庫(kù)，可以調(diào)用系統(tǒng)的控制軟件，適用于Windows 2000。濾波核的，也可以與圖像的卷積函數(shù)的MetaMorph分子設(shè)備公司（加利福尼亞州森尼韋爾），用于在IP實(shí)驗(yàn)室由Scanalytics公司（維吉尼亞州Fairfax）格式化。處理算法也得到了實(shí)現(xiàn)數(shù)字化的硬件，使640×480像素每秒110幀的圖像處理。由于中間圖像被數(shù)字化后，立即截獲，波前編碼處理是透明的，最終用戶，接收聚焦圖像，并且可以進(jìn)一步分析和歸檔。

　　HTS熒光法應(yīng)用擴(kuò)展聚焦與波前編碼光學(xué)系統(tǒng)的另一個(gè)特點(diǎn)是其適用于范圍廣泛的顯微鏡成像模式和應(yīng)用程序，如明，暗場(chǎng)，熒光，霍夫曼調(diào)制對(duì)比度，DIC，和偏振成像方式。下面的示例演示，波前編碼顯微鏡的效用并不限于明場(chǎng)成像的組織和細(xì)胞的準(zhǔn)備，但可以用來改善即使是最先進(jìn)的熒光檢測(cè)。

　　發(fā)現(xiàn)在許多應(yīng)用程序中使用的微量滴定板中提出misfocus滑動(dòng)成像中所遇到的類似問題。將市售的塑料底的96孔微量培養(yǎng)板的高度而變化，從中心到邊緣超過3000微米，或單井一半的直徑為6毫米的水平位移井由多達(dá)30微米的。三張影像序列顯示1微米堅(jiān)持底部的微孔板與的40X/0.6 ELWD目標(biāo)和濱松光電奧卡2 CCD相機(jī)（見圖4）使用倒置顯微鏡的熒光珠，被送往附近的圖像4A井邊，重點(diǎn)手動(dòng)設(shè)置。顯微鏡載物臺(tái)，然后在兩個(gè)步驟中的孔的中心與不調(diào)整焦點(diǎn)位置的情況下獲得的圖像在每個(gè)位置移向。畫像4b和4c顯示顯著的misfocus，導(dǎo)致亮度降低，作為光從胎圈著越來越大的區(qū)域被擴(kuò)大。

　　重復(fù)該實(shí)驗(yàn)，使用相同的光學(xué)配置，除了DIC插槽上的物鏡轉(zhuǎn)換器，波前編碼的光纖被插入。在影像D-F的Wavefront Coded處理圖像顯示很少或沒有misfocus?？紤]如果需要HTS用戶打算在這三個(gè)位置執(zhí)行一個(gè)離散的細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)該微孔的數(shù)量的步驟。假設(shè)聚焦驗(yàn)證，將需要至少四個(gè)在每個(gè)點(diǎn)的圖像，然后只有三個(gè)不同的位置所需要的15個(gè)步驟的采集和載物臺(tái)移動(dòng)。波前編碼光學(xué)，只有第一聚焦步驟是必要的，需要七個(gè)步驟進(jìn)行圖像采集和舞臺(tái)重新定位。

　　波前編碼光學(xué)系統(tǒng)提供的替代品的情況下，內(nèi)或interimage misfocus限制的成像系統(tǒng)的吞吐量和效率。然而，某些成像應(yīng)用程序不受益于擴(kuò)展深度成像。有些圖像分析光學(xué)部分厚厚的標(biāo)本，利用高解析度的目標(biāo)領(lǐng)域的深度有限。根據(jù)客觀的數(shù)值孔徑，視場(chǎng)的深度可能是小至0.5微米，從而使非常薄的部分的可視化。在這種情況下，將不適合的Wavefront Coded光學(xué)對(duì)焦清晰，因?yàn)樗鼛砹苏麄€(gè)標(biāo)本量。

　　所有的圖像處理算法傾向于擴(kuò)增現(xiàn)有的隨機(jī)的背景噪聲，波前編碼光學(xué)處理也不例外。但是，也有一些戰(zhàn)略擴(kuò)展焦圖像中的噪聲放大最小化。隨機(jī)系統(tǒng)中的噪聲的主要來源是攝像機(jī)的電子噪聲。波前編碼光學(xué)器件，可適應(yīng)幾乎所有市售的攝像頭，這樣的設(shè)備的選擇與適當(dāng)?shù)母遱ignal-to-noise比不是一種限制。

　　此外，隨機(jī)噪聲的放大成比例增加的場(chǎng)的深度延伸。波前編碼的光纖配置決定的場(chǎng)深度的增加量，并應(yīng)選擇提供了足夠的增加的特定應(yīng)用程序。的景深。添加過量的擴(kuò)展是可能避免的噪聲。

　　擴(kuò)展深度與波前編碼光學(xué)成像提供了一種工具，以提高自動(dòng)化顯微成像應(yīng)用。雖然這種技術(shù)的光學(xué)系統(tǒng)和信號(hào)處理相結(jié)合的方式中，表示的基團(tuán)出發(fā)，融入??自動(dòng)化系統(tǒng)需要稍加修改的光學(xué)系統(tǒng)，只是增加了一個(gè)可管理的附加步驟的信號(hào)處理和數(shù)據(jù)分析管道。信號(hào)處理之后，可以進(jìn)一步分析的擴(kuò)展深度圖像存檔的相同的方式在傳統(tǒng)的顯微鏡系統(tǒng)。通過將波前編碼光學(xué)系統(tǒng)，通過消除或減少需要的樣品的數(shù)字化過程中的焦點(diǎn)調(diào)整，可實(shí)現(xiàn)顯著的時(shí)間節(jié)省。隨著越來越多的成像檢測(cè)技術(shù)變?yōu)榭捎?，波前編碼更大量的數(shù)據(jù)在相同或更少的時(shí)間時(shí)，與使用傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡的系統(tǒng)相比，可用于采集。

　　參考文獻(xiàn)

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