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		DNA基因定位得到較為廣泛的研究和應(yīng)用

　　EST指通過(guò)對(duì)cDNA 文庫(kù)隨機(jī)挑取的克隆進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序所獲得的cDNA 5′或3′端序列。隨著EST計(jì)劃在不同物種間的不時(shí)擴(kuò)展和深入研究，長(zhǎng)度一般為150500bp自從美國(guó)科學(xué)家Craigvent首次提出EST計(jì)劃以來(lái)。數(shù)據(jù)庫(kù)中已積累了大量的EST20003年10月為止，NCBIdhEST中列出了451565個(gè)雞的EST占所有物種數(shù)據(jù)總量的六分之一，其中大多數(shù)來(lái)自Boardman等的研究效果。Boardman等把21個(gè)來(lái)自雞胚和不同組織的323670個(gè)測(cè)序片段組裝為85486個(gè)EST片段；根據(jù)這些EST數(shù)據(jù)同其他生物和雞已知基因的比較結(jié)果，估計(jì)雞的真實(shí)基因數(shù)量大約為35000個(gè)。大量EST序列的測(cè)定為微陣列的構(gòu)建提供了很好的基礎(chǔ)。目前，世界上很多的實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行雞的EST工程的研究，例如，美國(guó)特拉華州大學(xué)，德國(guó)國(guó)家環(huán)境與健康研究中心。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建了雞肌肉和肝臟的基因表達(dá)芯片，對(duì)雞肌肉和肝臟基因的時(shí)空表達(dá)差異進(jìn)行了研究。

　　分子標(biāo)志雖然僅誕生十幾年。并在家禽的遺傳分析、群體遺傳學(xué)研究、基因定位及育種等方面得到較為廣泛的研究和應(yīng)用。利用分子標(biāo)志技術(shù)加速家禽品種的遺傳改良和專門化品系的培育是21世紀(jì)畜牧業(yè)發(fā)展的肯定趨勢(shì)。隨著分子標(biāo)志手段的不時(shí)更新和完善，但已經(jīng)形成了多種檢測(cè)方法。其應(yīng)用的深度和廣度也在不時(shí)推進(jìn)，并出現(xiàn)了大量新的高效的特異的現(xiàn)代標(biāo)志技術(shù)，如隨機(jī)微衛(wèi)星擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記(RMA PD相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記(SRA P靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記(PA P等。但是相對(duì)于其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和家畜，分子遺傳標(biāo)志在家禽尤其是鴨、鵝等的研究中還沒(méi)有得到充分的應(yīng)用。作為世界養(yǎng)禽大國(guó)，今后應(yīng)該在加強(qiáng)家禽重要經(jīng)濟(jì)性狀分子遺傳機(jī)制研究、進(jìn)一步開展基因定位和發(fā)展基因診斷技術(shù)的同時(shí)，充分利用我國(guó)豐富的種質(zhì)資源，及時(shí)有效的應(yīng)用DNA 分子標(biāo)志技術(shù)，加速家禽專門化品系的培育，以提高養(yǎng)禽業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

　　DNA 分子標(biāo)志技術(shù)研究始于20世紀(jì)80年代。DNA 水平上遺傳多態(tài)性的直接反映。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，指能夠反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA 片段。先后發(fā)生了數(shù)十種DNA 分子標(biāo)志技術(shù)，主要分為三類：第一類是以分子雜交為核心的分子標(biāo)志技術(shù)；第二類是以PCR為核心的分子標(biāo)志技術(shù)；第三類是以DNA 序列為核心新型的分子標(biāo)志技術(shù)。由于分子標(biāo)志比傳統(tǒng)的生化標(biāo)志有遺傳穩(wěn)定、變異豐富、準(zhǔn)確度高、不受表型影響及不同發(fā)育階段和不同組織的DNA 均可用于分析等優(yōu)點(diǎn)，所以被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、植物及微生物的相關(guān)研究。近年來(lái)，家禽的品種品系鑒定、遺傳多樣性研究、重要經(jīng)濟(jì)性狀候選基因研究、遺傳距離的估測(cè)和基因圖譜的制作等許多方面都應(yīng)用了分子標(biāo)志技術(shù)。筆者對(duì)家禽的分子遺傳標(biāo)志相關(guān)研究進(jìn)展綜述如下。

　　以Southern雜交為核心的分子標(biāo)志技術(shù)。而且并非任何內(nèi)切酶都能發(fā)生多態(tài)性，最具代表性的發(fā)現(xiàn)最早的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP標(biāo)志。RFLP標(biāo)志主要用于遺傳連鎖圖譜的繪制和目的基因標(biāo)志。由于其多態(tài)信息含量不高(僅為0.2左右)制備特異探針需分離其相應(yīng)的編碼基因。再加上技術(shù)復(fù)雜，有放射性污染等，使其充分應(yīng)用受到很大程度的限制。近年來(lái)，有人將RFLP標(biāo)志與PCR技術(shù)結(jié)合起來(lái)應(yīng)用，進(jìn)一步發(fā)展了RFLP遺傳標(biāo)志，目前，該技術(shù)在家禽遺傳分析等方面已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。潘愛(ài)鑾等、王志躍等、Zhou等、張湯杰等均采用PCR-RFLP對(duì)不同品種雞的LPL基因、IGF基因進(jìn)行多態(tài)性分析。

　　1985年Jeffrei等制備出在哺乳動(dòng)物和鳥類基因組DNA 中檢測(cè)出高度多態(tài)性的兩個(gè)小衛(wèi)星探針。低嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下，即33.15探針和33.6探針。用類似于RFLP分析方法。利用小衛(wèi)星探針與基因組DNA 酶切片段進(jìn)行Southern雜交，可以得到10多條的雜交圖帶。由于不同的個(gè)體得到不同雜交圖譜，就像不同的人具有特異的指紋標(biāo)識(shí)一樣，所以稱之為DNA 指紋。

　　DNA 指紋具有多位點(diǎn)性、高變異性、簡(jiǎn)單而穩(wěn)定的遺傳性及體細(xì)胞穩(wěn)定性等4個(gè)特點(diǎn)。EcoRI為限制性內(nèi)切酶分別對(duì)新?lián)P州雞和京海I號(hào)黃雞DNA 指紋圖譜進(jìn)行了研究。結(jié)果標(biāo)明DNA 指紋J帶可作為新?lián)P州雞和京海I號(hào)黃雞增重的遺傳標(biāo)志進(jìn)行標(biāo)志輔助選擇。目前主要應(yīng)用于測(cè)定品系的遺傳純度和品系間的遺傳距離以及尋找與重要經(jīng)濟(jì)性狀基因相連鎖的遺傳標(biāo)志。盛浩偉等以EA V禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒片段)為探針。

　　William和Welsh等于1990年首次運(yùn)用隨機(jī)引物對(duì)基因組DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目前已應(yīng)用于家禽群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析。勝利獲得了作為分子標(biāo)志的多態(tài)DNA 片段。1993年我國(guó)科學(xué)家構(gòu)建了國(guó)際上第一張也是最大的雞RA PD遺傳圖譜。RA PD技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便快捷、所用引物較短(通常為10個(gè)堿基)引物來(lái)源豐富而廣泛、無(wú)需知道引物和模板DNA 序列、相同引物可以用于不同動(dòng)物的基因組DNA 多態(tài)性檢測(cè)、資料面廣、樣品用量少、靈敏度高等特點(diǎn)。

　　1993年由荷蘭科學(xué)家Zabeau等創(chuàng)建的AFLP分子標(biāo)志技術(shù)。然后把擴(kuò)增的酶切片段在高分辨率的順序分析膠上進(jìn)行電泳，利用PCR技術(shù)檢測(cè)DNA 多態(tài)性的一種新方法。AFLP原理是通過(guò)PCR反應(yīng)先把酶切片段擴(kuò)增。多態(tài)性即以擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度不同被檢測(cè)出來(lái)。由于該標(biāo)記結(jié)合了RFLP和RA PD各自的優(yōu)點(diǎn)，只需要極少量DNA 資料，不需要預(yù)先知道基因組的序列信息，目前在動(dòng)物的遺傳多樣性分析和品種鑒定等方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì)，尤其是適于對(duì)遺傳多樣性較貧乏的近緣品種(系)瀕危品種及遺傳背景了解極少的種群的遺傳分析。高玉時(shí)等利用AFLP標(biāo)志對(duì)我國(guó)12個(gè)地方雞種和引進(jìn)雞種隱性白羽雞進(jìn)行了遺傳檢測(cè)，結(jié)果標(biāo)明AFLP指紋用于我國(guó)地方雞種的遺傳多樣性分析、品種鑒定及品種間親緣關(guān)系分析是可行的

　　微衛(wèi)星是上世紀(jì)80年代末期發(fā)展起來(lái)的一種新型分子標(biāo)志。與傳統(tǒng)的標(biāo)志方法相比。因其高度的多態(tài)性、廣泛而又隨機(jī)地分布于整個(gè)基因組以及共顯性遺傳的特點(diǎn)，微衛(wèi)星標(biāo)記。目前已經(jīng)成為群體遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性研究中的最普遍最有效的工具之一。微衛(wèi)星多態(tài)性分析在畜禽遺傳多樣性評(píng)估、品種資源的分類和保管等方面發(fā)揮著重要作用。

　　家禽遺傳多樣性評(píng)估方面。歐洲觀賞型雞品種的遺傳多樣性比較低，Hilliel等、Granevitz等的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)。亞洲的地方雞種具有較高的遺傳多樣性，與品種的培育歷史相吻合。Berthouli等基于22個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)志分析了歐洲和亞洲雞種的遺傳多樣性，并與歐洲AVIA NP項(xiàng)目所使用的14個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的結(jié)果作了比較，結(jié)果標(biāo)明AVIA NP框架適用于本地品種的遺傳多樣性研究。國(guó)內(nèi)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所和中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)利用微衛(wèi)星標(biāo)記在家禽方面做了大量系統(tǒng)的研究。

　　品種資源的分類和保存方面。將該DNA 指紋分析結(jié)果與各雞群體形態(tài)學(xué)標(biāo)志相結(jié)合，高玉時(shí)等認(rèn)為利用雞群體(品系、品種)微衛(wèi)星DNA 特征指紋?？梢詾殡u種的親緣關(guān)系鑒定及維護(hù)新品種的知識(shí)產(chǎn)權(quán)提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為監(jiān)測(cè)各配套品系的選育效果、預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)提供參考價(jià)值。同時(shí)建立了地方雞品種保種群微衛(wèi)星標(biāo)志檔案，并分析世代間的差異，預(yù)期可以達(dá)到監(jiān)測(cè)保種效果的目的

　　自20世紀(jì)60年代。很多學(xué)者對(duì)mtDNA 進(jìn)行了大量的研究，NassM和NassS雞胚中通過(guò)電鏡證實(shí)了線粒體內(nèi)存在遺傳物質(zhì)即線粒體DNA 以來(lái)。很多種動(dòng)物的mtDNA 全序列已經(jīng)全部測(cè)定。mtDNA 種間、種內(nèi)群體間和群體內(nèi)具有廣泛的多態(tài)性，分子進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育中有許多獨(dú)特的優(yōu)越性，作為有用的遺傳標(biāo)志已廣泛應(yīng)用在家禽的遺傳育種中。Liu等利用mtDNA 高變區(qū)分析了日本斗雞和中國(guó)斗雞的起源關(guān)系，驗(yàn)證了日本斗雞具有雙重起源，即起源于中國(guó)和東南亞，但也不排除其獨(dú)立起源于中國(guó)的可能。何大乾測(cè)定了中國(guó)家鴨和野鴨線粒體DNA D-loop區(qū)序列，并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中國(guó)家鴨具有單一的母系起源，即起源于綠頭野鴨，品種形成過(guò)程中摻入了少量斑嘴鴨血緣，中國(guó)家鴨品種間的遺傳差異小。Shi等分析了16個(gè)中國(guó)家鵝品種、2個(gè)歐洲鵝品種以及1個(gè)中國(guó)鵝和歐洲鵝雜交品種的mtDNA 多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中國(guó)鵝種和西方鵝種之間沒(méi)有共享單倍型，支持中國(guó)家鵝起源于鴻雁而歐美鵝種起源于灰雁的觀點(diǎn)。

　　單核苷酸多態(tài)性(SNP指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA 序列多態(tài)性。為DNA 芯片技術(shù)應(yīng)用于遺傳作圖提供了基礎(chǔ)。SNP標(biāo)志具有雙等位基因的特點(diǎn)，人類和動(dòng)物基因組中普遍存在一種分子標(biāo)記。SNP目前最有發(fā)展前途的一類新型DNA 標(biāo)志。目前正廣泛地應(yīng)用于家禽重要經(jīng)濟(jì)性狀研究領(lǐng)域，有目的導(dǎo)入有利基因或剔除有害基因，拓寬或拓新家禽的經(jīng)濟(jì)用途，提高生產(chǎn)性能。

　　雞生長(zhǎng)、肉質(zhì)等經(jīng)濟(jì)性狀上。為進(jìn)一步分析A-FA BP基因的遺傳變異與肌內(nèi)脂肪含量的關(guān)系及該分子標(biāo)記在育種計(jì)劃中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。束婧婷等以ADSL基因、GA RS-A IRS-GA RT基因作為影響雞肌肉肌苷酸含量的候選基因，陳寬維等檢測(cè)了尤溪麻雞、鹿苑雞和隱性白羽雞的A-FA BP基因第85和1805位點(diǎn)的遺傳變異。并對(duì)2個(gè)基因的多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行了合并基因型的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)合并基因型的效應(yīng)不是各自基因型效應(yīng)的簡(jiǎn)單相加，但卻要高于最好的單個(gè)基因型效應(yīng)。孫文浩等分析了對(duì)雞肉質(zhì)和風(fēng)味有重要作用的Myf6基因的遺傳效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因多態(tài)性對(duì)雞的肌纖維密度和直徑以及局部胴體性狀均產(chǎn)生一定的遺傳效應(yīng)。Lei等對(duì)來(lái)自生長(zhǎng)軸上8個(gè)基因的30個(gè)SNP和1個(gè)6bp插入/缺失突變位點(diǎn)與雞肥度和肌纖維性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果標(biāo)明，生長(zhǎng)軸上的基因不只與生長(zhǎng)和體沉積有關(guān)，還與肥度和肌纖維性狀相關(guān)聯(lián)。Ouyang等以GHR為候選基網(wǎng)，F(xiàn)2代全同胞資源群體中對(duì)其cDNA 全序列進(jìn)行SNP掃描，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNP3個(gè)位點(diǎn)的單倍型與公雞7213542495670和77日齡體重存在關(guān)聯(lián)，與77日齡皮下脂肪厚也有關(guān)聯(lián)，并與7和14日齡母雞體重有關(guān)聯(lián)。Zhang等分析了CA PN1基因?qū)?個(gè)肉用型雞種胴體和肉質(zhì)性狀的遺傳效應(yīng)，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNP其單倍型組合與活重、胴體重、胸肌重、腿肌重以及胸肌肌纖維密度有顯著關(guān)聯(lián)，CA PN1基因可能是影響雞肉質(zhì)性狀的主效基因或與主效基因相連鎖。

　　目前為止。有限的關(guān)于鴨、鵝功能基因的研究中也只克隆了局部或全長(zhǎng)cDNA 鮮少關(guān)于基因多態(tài)與重要經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性研究報(bào)道。許盛海等利用PCR-SSCP方法在8個(gè)鴨種中對(duì)生長(zhǎng)激素基因編碼區(qū)及調(diào)控區(qū)的序列進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析，關(guān)于水禽分子標(biāo)志的研究報(bào)道非常有限。結(jié)果共發(fā)現(xiàn)3個(gè)突變位點(diǎn)，基因型頻率的分布與品種有關(guān)，推測(cè)所檢測(cè)到多態(tài)位點(diǎn)可能與生產(chǎn)性能相關(guān)。趙文明等利用PCR-SSCP方法對(duì)籽鵝生長(zhǎng)激素基因內(nèi)含子3進(jìn)行了單核苷酸多態(tài)性分析，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)了7個(gè)突變位點(diǎn)，3種基因型，其中BB基因型為優(yōu)勢(shì)基因型。Wu等在北京鴨和櫻桃谷北京鴨群體重分析LPL基因外顯子7變異對(duì)生長(zhǎng)和腹脂性狀的效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外顯子7C91T突變可能與影響腹脂性狀的潛在主效位點(diǎn)相連鎖。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)李寧教授研究小組首次嘗試將與北京鴨生長(zhǎng)、體尺性狀QTL緊密連鎖的分子標(biāo)志應(yīng)用于北京鴨的育種，這也是目前為止DNA 分子標(biāo)志技術(shù)在鴨育種中的唯一應(yīng)用。

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