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		SRAP基于PCR方法易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化

　　雜種優(yōu)勢(shì)育種是一種重要的育種技術(shù)。慣例雜種優(yōu)勢(shì)育種實(shí)踐中。育成新品種的周期長(zhǎng)，存在著大量組配、大量淘汰的現(xiàn)象。勝利率較低。而利用SRA P分子標(biāo)志技術(shù)預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)，可以從DNA 水平上了解雜交種的真實(shí)性，提高育種的選擇效率和預(yù)見(jiàn)性，加快新品種的選育進(jìn)程。Riaz等在用SRA P研究油菜的遺傳多樣性和雜種表示時(shí)，發(fā)現(xiàn)油菜的種子產(chǎn)量表示中親優(yōu)勢(shì)，變化范圍在16.9%26%絕大多數(shù)雜交種都超過(guò)它各自的自交系而且聚類分析時(shí)，分在不同類的雜交系的雜種優(yōu)勢(shì)比分在同一類的雜種優(yōu)勢(shì)強(qiáng)；因此，SRA P也可以用于數(shù)量性狀的基因定位。品種的分子鑒別研究方面，于拴倉(cāng)等在胚珠培養(yǎng)獲得秘魯番茄與栽培番茄的種間雜種的基礎(chǔ)上，采用RA PDRGA SRA P分子標(biāo)志技術(shù)從DNA 水平上分析親本及雜交后代間的遺傳差異性和相似性。統(tǒng)計(jì)分析標(biāo)明種間雜種整合了栽培番茄和秘魯番茄的遺傳信息，雜種的230個(gè)位點(diǎn)中包含了30.4%栽培番茄特有信息、20.9%秘魯番茄特有信息、46.5%共有信息；種間雜種與母本栽培番茄的基因組相似性達(dá)72.5%而與秘魯番茄的基因組相似性為50.8%雜種明顯偏向母本栽培番茄。由此可見(jiàn)，所得的種間雜種整合了栽培番茄和秘魯番茄的遺傳信息。

　　SRA P基于PCR方法。以此為基礎(chǔ)，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。結(jié)合其它標(biāo)志，可得到更加精確滿意的結(jié)果。一旦SRA P標(biāo)志與現(xiàn)有的育種順序結(jié)合起來(lái)很有可能成為商業(yè)育種中快速取得經(jīng)益的輔助技術(shù)。作為一個(gè)理想的分子標(biāo)志技術(shù)，SRA P以它簡(jiǎn)便、中等產(chǎn)量、可顯示大量的共顯標(biāo)志和易于得到測(cè)序所需的分離條帶、擴(kuò)增ORF區(qū)域等優(yōu)點(diǎn)，將在蔬菜植物應(yīng)用中展現(xiàn)出更廣闊的發(fā)展前景。

　　序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性又稱為基于序列擴(kuò)增多態(tài)性(SequencRelatA mplifiPolymorphSRA P也有的文獻(xiàn)譯為相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性。由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜作物系Li和Quiro博士首次正式提出SRA P為新一代分子標(biāo)志。針對(duì)基因外顯子里GC含量豐富而啟動(dòng)子和內(nèi)含子里AT含量豐富的特點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，一種基于PCR分子標(biāo)志系統(tǒng)。2001年。因不同個(gè)體的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長(zhǎng)度不等而發(fā)生多態(tài)性因子。SRA P標(biāo)志已在水稻、棉花、番茄、馬鈴薯、柑橘、大蒜、辣椒、黃瓜、芹菜、油菜、擬南芥和小麥等植物研究中得到勝利應(yīng)用，具有簡(jiǎn)便、中等產(chǎn)量、高共顯性、重復(fù)性、易于分離條帶及測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)，適合基因定位、基因克隆、遺傳圖譜構(gòu)建等生物學(xué)研究。

　　SRA P分子標(biāo)志中引物的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵。緊接著是CCGG一起組成核心序列，利用獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)對(duì)(OpenReadFrameORF開放式閱讀框進(jìn)行擴(kuò)增。正向引物長(zhǎng)17bp5′端的前10bp一段非特異性的填充序列。然后是靠著3′端的3個(gè)選擇性堿基，對(duì)外顯子進(jìn)行擴(kuò)增。反向引物長(zhǎng)18bp即由5′的11個(gè)無(wú)特異性的填充序列和緊接著的AA TT組成的核心序列，及3′的3個(gè)選擇性堿基，對(duì)內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增；因個(gè)體不同以及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔長(zhǎng)度不等而發(fā)生多態(tài)性擴(kuò)增產(chǎn)物。

　　研究標(biāo)明。如擬南芥2和4號(hào)染色體的全序列中，外顯子一般處于富含GC區(qū)域。外顯子CG比例分別為46.15%和44.08%而內(nèi)含子中則為32.1%和33.08%而且除著絲粒區(qū)域有較低基因密度外，基因幾乎平均分布在這兩個(gè)染色體上。從GenBank中隨機(jī)選擇20個(gè)BA C序列，發(fā)現(xiàn)約66%CCGG序列位于這些克隆中的外顯子內(nèi)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，擬南芥約1/3基因組外顯子位于24號(hào)染色體上。運(yùn)用CCGG序列就可特異擴(kuò)增出包括這些組分的序列。

　　當(dāng)然。富含AT區(qū)域序列通常見(jiàn)于啟動(dòng)子和內(nèi)含子中，由于外顯子序列在不同個(gè)體中通常是激進(jìn)的這種低水平多態(tài)性限制了將它做為標(biāo)記的來(lái)源。由于內(nèi)含子、啟動(dòng)子和間隔序列在不同物種甚至不同個(gè)體間變異很大。SRA P中使用的反向引物的3′端含有核心AA TT以特異結(jié)合富含AT區(qū)，這就使得有可能擴(kuò)增出基于內(nèi)含子與外顯子的SRA P多態(tài)性標(biāo)記。

　　SRA P標(biāo)志分析中共有兩套引物。也有用19bp反向引物的這些是由Li等在發(fā)展SRA P流程時(shí)對(duì)引物大小進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的引物設(shè)計(jì)時(shí)有一個(gè)原則，長(zhǎng)為17bp正向引物和長(zhǎng)為18bp反向引物。就是引物之間不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或其他二級(jí)結(jié)構(gòu)，GC含量在40%50%之間，正向和反向引物的填充序列在組成上必須不同，長(zhǎng)度為10l1bp試驗(yàn)標(biāo)明，用單引物擴(kuò)增只能擴(kuò)增幾條大約0.5lkh片段；使用較短引物，10bpRA PD引物，及含有SRA P引物核心序列的1415bp大小的引物，這些引物組合可得到多種擴(kuò)增片段，但是擴(kuò)增產(chǎn)物不穩(wěn)定，特異性不強(qiáng)；2022bp引物放射自顯影的結(jié)果背景太強(qiáng)；合適的引物大小在1718bp

　　1.2.2SRA P-PCR擴(kuò)增SRA P-PCR擴(kuò)增采用復(fù)性變溫法。先按94℃變性1min35℃退火1min72℃延伸1.5min順序，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min然后。進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；然后將退火溫度升至50℃，其他溫度仍然不變，再進(jìn)行3035個(gè)循環(huán)；最后，72℃再延伸5min即前5個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度35℃，后35個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度采用50℃。擴(kuò)增開始時(shí)采用低的退火溫度有利于兩引物與DNA 靶位點(diǎn)的結(jié)合，隨后循環(huán)中采用較高復(fù)性溫度可保證產(chǎn)物以指數(shù)方式擴(kuò)增。

　　擴(kuò)增產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后。回收后，從膠上割下獲得SRA P標(biāo)志差異片段。用相應(yīng)引物直接測(cè)序，必要時(shí)可采用克隆測(cè)序。由于SRA P發(fā)生高強(qiáng)帶，很少有重疊，而且引物較長(zhǎng)，故比激進(jìn)方法更易測(cè)序。

　　2SRA P標(biāo)志在蔬菜作物育種上的應(yīng)用

　　由于在不同的種、不同個(gè)體間具有一定的多態(tài)性SRA P技術(shù)已勝利應(yīng)用于種質(zhì)資源的鑒定與評(píng)價(jià)工作。對(duì)同一作物代表性資料用不同的分子標(biāo)志方法進(jìn)行遺傳多樣性分析和形態(tài)學(xué)分析。SRA P標(biāo)志比AFLPRA PDSSR等其它方法提供更優(yōu)良的信息。Ruiz等利用SSR和SRA P兩種方法對(duì)來(lái)自不同地方3個(gè)品種的番茄進(jìn)行了遺傳多樣性及親緣關(guān)系的研究。雖然SSR和SRA P都能得到結(jié)果，與形態(tài)學(xué)變異及類型的進(jìn)化史一致性方面。但是用SRA P標(biāo)志取得的結(jié)果分辨率更高些。Ferriol等運(yùn)用SRA PA FLP標(biāo)志和形態(tài)學(xué)標(biāo)記分析了69份甜瓜(Cucurbitamaxima遺傳多樣性，將其分為兩個(gè)亞種和8個(gè)生態(tài)型，生態(tài)型變異性和生態(tài)型進(jìn)化史上，SRA P標(biāo)志提供的信息比AFLP更優(yōu)良。另外，F(xiàn)erriol等對(duì)筍瓜(Cucurbitamaxima19份種質(zhì)資源進(jìn)行了SRA PRA PD分析，對(duì)育種目標(biāo)性狀的評(píng)價(jià)方面，SRA P標(biāo)志明顯優(yōu)于RA PD標(biāo)志Ferrio1等運(yùn)用SRA P技術(shù)進(jìn)行了南瓜的遺傳多樣性評(píng)價(jià)。李嚴(yán)等進(jìn)行西瓜雜交種遺傳多態(tài)性的研究，利用25個(gè)引物組合對(duì)當(dāng)前生產(chǎn)上推廣的20個(gè)西瓜雜交種進(jìn)行擴(kuò)增，從中篩選得到20個(gè)多態(tài)性引物組合，共產(chǎn)生135個(gè)多態(tài)性條帶，平均每個(gè)引物組合產(chǎn)生7.11個(gè)多態(tài)性條帶，顯示了較高的多態(tài)性比率。聚類分析20個(gè)引物組合的擴(kuò)增結(jié)果，20份材料分為3大類，相似系數(shù)在0.290.86之間。這些都說(shuō)明了SRA P一個(gè)評(píng)價(jià)遺傳多樣性、品種鑒定和系統(tǒng)發(fā)生的有效工具。

　　目前。構(gòu)建了一張由130個(gè)SRA P標(biāo)志和120個(gè)AFLP標(biāo)志組成的遺傳圖譜。此圖共有9個(gè)重要連鎖群，運(yùn)用SRA P標(biāo)志構(gòu)建遺傳圖譜已有成功的例子。Li等對(duì)羽衣甘藍(lán)×花椰菜的86個(gè)RIL群體作圖?？傞L(zhǎng)2165cmSRA P和AFLP都均勻地分布在連鎖群上，AFLP標(biāo)志為顯性標(biāo)記，而約20%多態(tài)性SRA P分離為共顯性標(biāo)記。王剛等應(yīng)用SRA P標(biāo)志構(gòu)建黃瓜連鎖圖譜，以黃瓜的兩個(gè)自交系S06與S52雜交發(fā)生的F2群體為作圖群體，使用篩選出的64個(gè)多態(tài)性引物組合對(duì)F2群體進(jìn)行檢測(cè)分析，得到108個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，獲得由92個(gè)標(biāo)志座位組成、覆蓋7個(gè)連鎖群、總長(zhǎng)1164.2cm標(biāo)志平均間距12.6cm遺傳圖譜。潘俊松等以黃瓜自交系S06與S52雜交發(fā)生的F2群體(共93個(gè)單株)為作圖群體，應(yīng)用SA P標(biāo)志構(gòu)建了黃瓜的分子遺傳框架圖譜：篩選多態(tài)性較好的64個(gè)引物組合進(jìn)行群體檢測(cè)，共得到108個(gè)多態(tài)性條帶；用Mapmakeir/EXP3.0構(gòu)建連鎖群，77個(gè)標(biāo)志位點(diǎn)進(jìn)入9個(gè)大的連鎖群(LOD≥3.0總長(zhǎng)l114.2cm標(biāo)志平均間距14.5cm標(biāo)志間最大間距36.2cm最小0.5cm標(biāo)志均勻分布于整個(gè)連鎖群，沒(méi)有聚集在某一個(gè)區(qū)域的現(xiàn)象。

　　2.3重要性狀的標(biāo)志

　　蔬菜作物中。那么在以后的新品種的選育、性狀標(biāo)志的輔助選擇等方面都具有重大的作用。Li等在大白菜中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與雄性不育基因有關(guān)的SRA P標(biāo)志；油菜中篩選到一個(gè)與Rf連鎖的SRA P標(biāo)志；芹菜中獲得了一個(gè)與病毒抗性基因緊密連鎖的SRA P標(biāo)志。潘俊松等在黃瓜中，如果一些重要性狀能夠標(biāo)志進(jìn)去。將始花節(jié)位性狀控制基因ffn定位在第Ⅸ連鎖群上。

　　研究比較基因組學(xué)對(duì)研究物種的起源和進(jìn)化都具有很重要的意義。利用基于PCRcDNA -SRA P分析來(lái)檢測(cè)編碼區(qū)的多態(tài)性具有簡(jiǎn)便、快捷、高效的特點(diǎn)。Li等用花椰菜DH植株與青花菜雜交產(chǎn)生的F2群體88個(gè)單株，而轉(zhuǎn)錄圖譜是進(jìn)行比較基因組學(xué)研究極為有效的手段。使用48個(gè)引物組合，從88個(gè)cDNA 中檢測(cè)到281個(gè)多態(tài)性cDNA -SRA P標(biāo)志，平均每個(gè)引物對(duì)產(chǎn)生6個(gè)，21.1%為共顯性，構(gòu)建了由247個(gè)標(biāo)記組成的轉(zhuǎn)錄圖譜。進(jìn)一步利用這個(gè)圖譜，勝利進(jìn)行了甘藍(lán)類蔬菜作物與擬南芥基因組的基因排列與組成分析，發(fā)現(xiàn)這兩類基因組的廣泛同一性，190個(gè)多態(tài)性cDNA -SRA P標(biāo)志中，共有169個(gè)相似序列；這種同一性集中在某些染色體片段而非整個(gè)染色體上；甘藍(lán)中大多數(shù)重復(fù)區(qū)段集中對(duì)應(yīng)于擬南芥1號(hào)與5號(hào)染色體，而不是2號(hào)與4號(hào)染色體。說(shuō)明這兩種植物的染色體片段的基因組有很高的同源性。

　　多數(shù)SRA P標(biāo)志包括了可譯框中的外顯子。該基因位于5號(hào)染色體上，這為特定性狀基因的分離克隆提供了極大方便。Li等通過(guò)RIL群體獲得基因的顯性標(biāo)記SRA P133與擬南芥中BA C克隆F4C21中一未知基因的可譯框高度同源。此基因座已經(jīng)定位了一個(gè)去飽和基因。據(jù)此推測(cè)標(biāo)志SRA P也在這個(gè)基因內(nèi)部。

　　Li等利用SRA P技術(shù)獲得一個(gè)與基因共分離的標(biāo)志。勝利分離到基因；并通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化導(dǎo)入擬南芥，再用此標(biāo)志序列來(lái)篩選青花菜BA C文庫(kù)的一個(gè)BA C克隆。進(jìn)行了該基因的功能分析。同時(shí)正在從結(jié)球白菜的花粉母細(xì)胞、減數(shù)分裂期的花蕾分離出mRNA 進(jìn)行cDNA SRA P指紋圖譜分析，以期克隆一些特異表達(dá)的基因，并初步獲得PMC特異表達(dá)的基因。

　　利用SRA P進(jìn)行QTL定位研究。應(yīng)用QTLMapperl.6各檢測(cè)到4個(gè)控制黃瓜側(cè)枝數(shù)(Ibn和側(cè)枝平均長(zhǎng)度(Ibl數(shù)量性狀座位(QTL其中，可以發(fā)掘有用基因加速分子育種進(jìn)程。王剛等構(gòu)建黃瓜SRA P遺傳連鎖圖譜。對(duì)Ibn貢獻(xiàn)率最大的QTL位于第二連鎖群的MEllSA 4B-ME5EM5區(qū)間，其SO6基因型具有增效作用；對(duì)Ibl貢獻(xiàn)率最大的OTL位于第二連鎖群的DClOD3-DClEMl4區(qū)間，其SO6基因型具有增效作用，說(shuō)明用SRA P進(jìn)行OTL定位研究是非常有效的

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