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		質(zhì)譜法熒光胺法兩種方法進行準確測定的前提條

　　質(zhì)譜法由于PEG的分子量較大，多采用基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF）測定修飾前后生長激素的質(zhì)量數(shù)，將質(zhì)量數(shù)之差除以PEG的分子量，即可得到每一分子rhGH上，發(fā)生修飾的PEG數(shù)目。但是，由于MALDI-TOF脈沖式的離子化方式不能精確定量，對于發(fā)生多點修飾的rhGH，只能用該方法計算PEG的結合數(shù)目，而無法準確計算平均修飾率。因此，該方法只適用于計算單位點修飾藥物的平均修飾率。目前我國企業(yè)生產(chǎn)的3種PEG-rhGH，均為單位點修飾，利用MALDI-TOF測定的平均修飾率應為10%左右。

　　熒光胺法Stocka等人首先采用熒光胺法測定PEG修飾蛋白的平均修飾率[6]。該方法的靈敏度較高，僅需納克級的蛋白質(zhì)就能完成。熒光胺本身不發(fā)熒光，但可在堿性環(huán)境中共價結合到游離氨基上，生成具有高熒光強度的熒光衍生物。沒有參與反應的熒光胺則迅速水解為不發(fā)熒光的物質(zhì)。因此，與TNBS法相比，熒光胺法具有更高的靈敏度。與TNBS法相似，熒光胺法同樣受反應溫度、pH值、時間因素、游離氨基、還原物質(zhì)的影響，所以應針對不同的PEG化蛋白進行反應條件考察，并建立相應的rhGH工作對照品。同時，由于熒光胺在水溶液中分解極快，為保證操作的便捷與準確性，應將熒光胺的丙酮溶液直接加入到反應液中，并迅速混勻，而不宜在接觸到蛋白質(zhì)溶液之前用水溶液稀釋熒光胺。

　　TNBS法1966年，Habeeb等人采用三硝基苯磺酸（TNBS）與蛋白表面賴氨酸的ε-氨基和α氨基發(fā)生反應，生成在375nm處有特征吸收的三硝基苯酚（TNP）。對于采用游離氨基作為蛋白連接位點的PEG修飾蛋白，PEG修飾將直接減少蛋白表面的自由氨基，因此可以通過將吸光度值與蛋白濃度作圖，求得PEG-rhGH與rhGH的斜率，將兩者的斜率之差除以rhGH的斜率即可間接計算PEG的修飾程度。但是，該方法的影響因素較多，要求修飾前后的供試品中不得含有游離氨基，不得含有還原型物質(zhì)，不得含有SDS等表面活性劑，并且極易受到環(huán)境溫度、pH以及游離PEG的影響。同時，該方法中絡合物隨著反應時間的延長，吸光度值不斷下降，需要考察適宜的反應中止方法以保證測定準確性。而rhGH國家對照品中因為添加了甘氨酸等賦形劑，不能直接用于TNBS法的檢測。企業(yè)需考察 rhGH與PEG-rhGH在不含上述輔料劑型中的穩(wěn)定性，并提供rhGH的工作對照品。

　　PEG的平均修飾率目前，PEG修飾蛋白的質(zhì)量標準中平均修飾率的檢測方法主要有：三硝基苯磺酸（TNBS）法、熒光胺法、質(zhì)譜法、液相-示差/蒸發(fā)光檢測器聯(lián)用法等。其中，前兩種為間接測定法，要求對修飾前后的蛋白質(zhì)準確定量。該類方法屬普通的化學與熒光發(fā)光法，操作相對簡單；后兩種屬于直接測定法，雖然結果較為準確，但所用儀器較為特殊或昂貴。因此，建立質(zhì)量標準時，應考慮采用直接法獲得較為可靠的平均修飾率數(shù)值，隨后建立三硝基苯磺酸（TNBS）法或熒光胺法而納入標準。同時，如能成功建立直接法中的“液相-示差/蒸發(fā)光檢測器聯(lián)用法”，不僅可以準確控制單位點或多位點修飾的PEG-rhGH的平均修飾率，還可以同時進行游離PEG測定，以及PEG的定性鑒別。

　　上述兩種方法進行準確測定的前提條件是，無論修飾前后，rhGH都必須處于充分舒展的狀態(tài)，所有的結合位點都能充分暴露。但是，由于PEG枝杈型的空間位阻效應，同時方法易受常規(guī)變性劑的干擾，測定結果不可盲目追求理論平均修飾率10%，應根據(jù)多批次測定結果，合理制定限度范圍。

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