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		儀器子系統(tǒng)的設(shè)計(jì)選擇會(huì)影響檢測(cè)

　　基因芯片技術(shù)研究做出了巨大貢獻(xiàn)，在許多領(lǐng)域，包括增長(zhǎng)，老齡化，發(fā)病和進(jìn)展，對(duì)藥物的反應(yīng)，在植物和動(dòng)物的愈合。世界各地的研究人員繼續(xù)完善這項(xiàng)技術(shù)，把目光投向芯片的工具，為臨床診斷使用獲得監(jiān)管部門的批準(zhǔn)。什么是特別重要的是，微陣列成像系統(tǒng)應(yīng)該具有最高性能標(biāo)準(zhǔn)的芯片產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)，為方便解釋。

　　任何熒光微陣列成像系統(tǒng)的基本要求是在樣品上，以激發(fā)熒光染料，收集發(fā)射的光，并生成數(shù)字圖像的熒光信號(hào)。兩種通用方法可用于獲得這樣的圖像：激光激發(fā)，用光電倍增管（PMT）檢測(cè)器，并過(guò)濾白色光激發(fā)用的電荷耦合器件（CCD）檢測(cè)器1-4此外，基于激光的系統(tǒng)。使用一個(gè)非共聚焦或光路。盡管這兩個(gè)結(jié)果在這些平臺(tái)的微陣列樣品數(shù)字圖像中，在構(gòu)建這樣的工具的設(shè)計(jì)選擇，可以顯著地影響系統(tǒng)的整體性能。

　　檢測(cè)限，場(chǎng)均勻性和重現(xiàn)性的微陣列成像精度是最重要的指標(biāo)，尤其是在發(fā)展中國(guó)家的診斷不確定性的余地不大。光傳輸，光收集和信號(hào)處理儀器子系統(tǒng)的設(shè)計(jì)都影響這些指標(biāo)的表現(xiàn)。

　　熒光微陣列圖像采集激發(fā)光交貨。在以激光為基礎(chǔ)的系統(tǒng)中，一個(gè)單波長(zhǎng)的激光束的直徑為幾微米的掃描背部和來(lái)回的樣品，令人興奮的一次單個(gè)像素的區(qū)域代表。發(fā)射光通過(guò)激勵(lì)透鏡行進(jìn)，并收集由PMT表。PMT的每個(gè)光子的信號(hào)，然后將其轉(zhuǎn)換成數(shù)字值，用于表示各像素位置處的信號(hào)強(qiáng)度，以創(chuàng)建一個(gè)圖像進(jìn)行放大。

　　在一個(gè)白色的光系統(tǒng)中，一種廣譜如氙燈或水銀燈的白光光源提供激勵(lì)光。激發(fā)波長(zhǎng)選擇通過(guò)過(guò)濾的白光分解成更窄的波長(zhǎng)范圍內(nèi)。在該指示燈點(diǎn)亮大面積的樣品，并收集被一個(gè)固定的CCD陣列的整個(gè)視場(chǎng)的熒光發(fā)射。不同的時(shí)間，讓收集到足夠的光從樣品中創(chuàng)建一個(gè)代表圖像的CCD成像光圈打開。CCD陣列上的各像素位置處的信號(hào)強(qiáng)度，然后轉(zhuǎn)換為數(shù)字圖像。

　　激光照明集中在上面的樣品表面的一個(gè)小點(diǎn)的高功率的單色光。更高的功率密度，可提供更多的光的熒光分子，因此，少得多的時(shí)間需要用過(guò)濾的白色光激發(fā)的染料比。由于激光束掃描樣品，“住”在每個(gè)像素位置為幾微秒。與此相反，一個(gè)白色光源照在樣品上幾秒鐘或幾分鐘，而CCD集成在整個(gè)曝光時(shí)間發(fā)射信號(hào)。

　　發(fā)射光系列兩個(gè)重要的檢測(cè)器的特征，有助于系統(tǒng)的整體性能的線性范圍和量子效率。線性范圍表示的范圍內(nèi)的輸入信號(hào)強(qiáng)度超過(guò)該檢測(cè)器可以準(zhǔn)確地測(cè)量變化，例如，一個(gè)給定的輸入信號(hào)變化的程度會(huì)產(chǎn)生相同的輸出信號(hào)的變化程度。通常指定為電流之間的差異的本底噪聲和最高增益設(shè)置的線性范圍內(nèi)的PMT。例如，由濱松公司（新澤西州Bridgewater）濱松R3896 GenePix的微陣列掃描儀，用于在由：Axon儀器公司（盟市，加利福尼亞州）0.01-100μA，或四個(gè)數(shù)量級(jí)的范圍內(nèi)。從光電倍增管輸出的信號(hào)被轉(zhuǎn)換成一個(gè)16位的數(shù)字值，這意味著可分為216 = 65535步，覆蓋約4.5個(gè)數(shù)量級(jí)的強(qiáng)度值。通過(guò)改變電壓施加到它，這就決定了放大（增益）的信號(hào)作為電子穿過(guò)的PMT。4從光電倍增管輸出的信號(hào)的幅度調(diào)整

　　光電倍增管具有一個(gè)最佳的工作的線性范圍內(nèi)，在其上信號(hào)的反應(yīng)是最準(zhǔn)確的。如果增益設(shè)置低于此范圍，每個(gè)入射的光子將被轉(zhuǎn)換成一個(gè)電子的概率降低了。超過(guò)這個(gè)范圍，噪聲開始干擾信號(hào)測(cè)量準(zhǔn)確。對(duì)于濱松R3896，最佳的工作范圍是從500到1000，V.如果在此范圍內(nèi)，信號(hào)與噪聲之比的高，中，低強(qiáng)度的斑點(diǎn)的任何地方設(shè)置PMT增益不改變（參見圖1）。用戶可以在不同的電壓掃描不同樣品知道任何差異是由于生物效應(yīng)，不掃描參數(shù)。例如，GenePix的掃描儀中的PMT可以測(cè)量信號(hào)的變化，在約4個(gè)數(shù)量級(jí)在任何給定的電壓。 CCD檢測(cè)器的線性范圍內(nèi)，指定作為CCD陣列上的各孔中讀出的噪聲電平（即，在每個(gè)像素中測(cè)量的波動(dòng)，由于隨機(jī)誤差）的容量的比率。例如，常用的CCD陣列可能有井深20000電子（E-10，2000年的線性范圍，或約三個(gè)量級(jí)）和讀出噪聲。

　　大多數(shù)生命科學(xué)成像中所用的CCD的12-bit數(shù)字分辨率可分為212 = 4096步，或約3.5個(gè)數(shù)量級(jí)的信號(hào)值。的CCD的信號(hào)強(qiáng)度范圍內(nèi)調(diào)整，通過(guò)改變曝光時(shí)間。喜歡一個(gè)PMT，CCD陣列也線性增加積分時(shí)間。然而，暗電流，或信號(hào)所產(chǎn)生的隨機(jī)流過(guò)器件的電子在沒有光的情況下，按比例增加隨曝光和可能增加背景信號(hào)。

　　重要的是要注意，雖然一個(gè)CCD攝像機(jī)具有比線性范圍較窄的光電倍增管，熒光染料分子的線性范圍內(nèi)的生物樣品殘留在所有的處理步驟之后很少超過(guò)2.5個(gè)數(shù)量級(jí)。對(duì)于大多數(shù)生物應(yīng)用中，任一系統(tǒng)中的線性范圍應(yīng)該是合適的。為了充分利用在一個(gè)給定的圖像的最大范圍，亮點(diǎn)不飽和檢測(cè)器的儀器設(shè)置在任一系統(tǒng)中應(yīng)設(shè)置。如果一個(gè)系統(tǒng)演示線性的性能廣泛的設(shè)置，用戶可以選擇一個(gè)單一的設(shè)置給定類型的所有芯片樣品，從而消除變異的來(lái)源之一，更容易辨別哪些其他實(shí)驗(yàn)誤差的來(lái)源和真實(shí)的生物學(xué)差異。

　　檢測(cè)器的另一個(gè)重要特性是量子效率（QE），裝置發(fā)射相對(duì)于它接收輸入的光子信號(hào)的電子信號(hào)的措施。作為一個(gè)獨(dú)立的組成部分，大部分使用的CCD芯片成像系統(tǒng)有大約比標(biāo)準(zhǔn)光電倍增管的雙重更大??的QE。然而，在CCD和其它設(shè)計(jì)參數(shù)的12-bit數(shù)字分辨率的局限性，可以遠(yuǎn)大于的好處更大QE。例如，收集單個(gè)圖像的顯微鏡載片上的大小足夠大的CCD陣列是極其昂貴的。CCD成像系統(tǒng)捕捉多個(gè)圖像的樣品，然后將它們縫合在一起創(chuàng)建一個(gè)單一的形象。不精確的拼接，漂白，由于重疊區(qū)域和其他文物的多重曝光可以影響準(zhǔn)確定量。過(guò)度拼接的另一種方法可能是使用了用于相機(jī)的鏡頭減少到一個(gè)較小的CCD表面的面積比較大的微陣列。然而，在所有的光學(xué)系統(tǒng)中，如果檢測(cè)器是小于源，光收集效率的損失是不可避免的。

　　共聚焦與非共光學(xué)?；诩す獾奈㈥嚵袙呙鑳x，共聚焦非共光路設(shè)計(jì)可以使用。最初開發(fā)共聚焦光學(xué)圖像薄切片厚的樣品，例如細(xì)胞或組織（參見圖3）。，5共焦光學(xué)系統(tǒng)創(chuàng)建一個(gè)很窄的焦點(diǎn)深度，拒絕信號(hào)從窄的焦平面超出。在不同深度的重復(fù)掃描創(chuàng)建多個(gè)高品質(zhì)的光學(xué)部分可以改造成厚樣品的3-D圖像。與此相反，在微陣列上，大部分的背景從非特異性結(jié)合的滑動(dòng)面，這是在同一平面上的焦點(diǎn)作為樣品。芯片掃描共聚焦成像沒有優(yōu)勢(shì)?？梢允顾鼈兓瑒?dòng)或滑動(dòng)架的平坦度的細(xì)微變化特別敏感，在共聚焦系統(tǒng)的聚焦深度的非常窄的。

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