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		評估芯片熒光成像系統(tǒng)的性能特點(diǎn)

　　選擇單個組件，雖然是重要的，重要的是要認(rèn)識到，儀器的性能取決于如何，所有的元素都整合成一個完整的工作系統(tǒng)。的電子電路，對應(yīng)的光學(xué)元件，和移動部件的行為的所有影響的數(shù)據(jù)的質(zhì)量。通過比較和量化的掃描圖像，而不是簡單地檢討各個組件的規(guī)格，性能表征應(yīng)該總是做。

　　掃描儀校準(zhǔn)。微陣列掃描儀等分析儀器必須執(zhí)行一致，可以比較不同的結(jié)果，隨著時間的推移。此外，多個相同類型的工具必須科學(xué)的結(jié)果可以驗證，可以進(jìn)行比較，以便產(chǎn)生數(shù)據(jù)。重復(fù)性特別是關(guān)鍵芯片成像儀由于上游化學(xué)和生物處理步驟產(chǎn)生顯著的變化。事實上，實驗可重復(fù)性仍然FDA批準(zhǔn)用于診斷測試芯片的一個主要障礙。實驗誤差的來源和真實的變異生物更容易被隔離在一臺掃描儀，有助于最小的額外變化。然而，機(jī)械，光學(xué)，電子元件的使用壽命是有限的，所以性能會改變，因為儀器老化。一個強(qiáng)大的校準(zhǔn)程序，可確保隨著時間的推移和多個掃描器之間的可重復(fù)性。

　　掃描儀校準(zhǔn)需要一個已知的標(biāo)準(zhǔn)相匹配的儀器性能。這樣的標(biāo)準(zhǔn)可能包括的熒光材料的吸收和發(fā)射光相對應(yīng)的儀器可供選擇的激發(fā)和發(fā)射頻段。樣品必須是光穩(wěn)定的，這樣它給出了相同的重復(fù)長時間的使用后的信號輸出。例如，GenePix的掃描儀在出廠基準(zhǔn)產(chǎn)生一個穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)，使用定義的掃描設(shè)置指定的信號輸出。儀器附帶的測試標(biāo)準(zhǔn)，使用戶可以按照定期校準(zhǔn)程序隨著時間的推移，重新調(diào)整到基準(zhǔn)水平的儀器。多臺儀器可以進(jìn)行調(diào)節(jié)，以同樣的方式，使得它們都產(chǎn)生基準(zhǔn)信號電平，因此，在同一樣品產(chǎn)生相同的信號輸出。

　　檢測限。關(guān)于熒光成像最常見的誤解之一是，會有一個更光明的形象是一個更好的形象。不同類型和品牌的探測器，電子信號處理中的變化，模擬-數(shù)字轉(zhuǎn)換器的分辨率，以及其他設(shè)計上的差異，會產(chǎn)生不同的絕對強(qiáng)度值對于一個給定的功能。此外，顏色映射，對比度設(shè)置，甚至顯示器設(shè)置可以影響的表觀亮度不同的圖像。

　　檢測限指定小信號系統(tǒng)可以精確量化，不只是最低的信號，這可能是顯示器上可見。檢測限是最可靠的測量信號噪聲比（SNR）。6信噪比量化多么出色的系統(tǒng)可以解決信號從背景噪聲中的利益。對于成像應(yīng)用，信噪比計算公式為：

　　作為一個比喻，可以考慮尋找一個2米的高大的稻草人（信號）在麥田（背景）。如果所有的玉米稈1米高，則是平均背景低于的信號，和標(biāo)準(zhǔn)偏差（噪聲）也低，所以稻草人將是清晰可見的。如果所有的玉米稈2米高時，則是平均背景相同的信號，雖然噪聲仍然很低，稻草人將不可??見。最后，如??果高的玉米稈范圍為0.5?3米多高，平均分配的平均背景為1.75米。背景是低于信號，但高度（即噪聲）的變化將使其很難看到稻草人。

　　因此，對于成像應(yīng)用中，平均本底水平和背景的標(biāo)準(zhǔn)偏差必須被包含在計算中。在許多信號檢測學(xué)科作為樣本值SNR = 3.6，7下面這一點(diǎn)，功能可能是肉眼可見的最小信號，可以準(zhǔn)確量化的一個標(biāo)準(zhǔn)已建立，但準(zhǔn)確量化能力顯著減弱。

　　這是極其困難的一個絕對的標(biāo)準(zhǔn)量化的檢出限為熒光染料，僅僅是因為許多染料敏感的環(huán)境條件，特別是光與年齡。為了使這樣一個標(biāo)準(zhǔn)，用戶必須量化熒光光譜儀上的樣品中的染料被發(fā)現(xiàn)確切的摩爾量，附著到滑動時的特定的協(xié)議都在使用的溶液的體積，也知道?？梢詻]有postspotting的洗滌或其他治療，可能危及初步定量。即使有這樣的精心準(zhǔn)備，絲毫衰減信號可能會導(dǎo)致樣品褪色低于檢測極限。

　　然而，在實踐中，與檢出限的值附近的任何芯片可以被用于簡單的掃描儀比較。要進(jìn)行這樣的測試，兩個或兩個以上的相同的樣品應(yīng)掃描在兩個單獨(dú)的工具，然后交換，并再次掃描正常化從在第一次掃描中的任何有害的影響（例如，光漂白）。SNR與低信號電平的一些相同的特征的比較，可以用來評估檢出限的差異，即使絕對的染料濃度是不提供這些功能的。

　　場均勻性均勻成像領(lǐng)域，確保數(shù)據(jù)可以準(zhǔn)確地比較來自不同領(lǐng)域的微陣列玻片上。一個主要的因素，決定場的均勻性是幻燈片本身。最標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡載物片被指定為約40μm的整個表面上的平整度，表示滑動可能具有高低至40微米的小山和山谷。這些表面的變化轉(zhuǎn)化為定量的變化，特別是在景深的共聚焦系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中，可能只有32-63微米。在這種系統(tǒng)中，樣品表面會進(jìn)來的重點(diǎn)，因為它掃描。à系統(tǒng)具有較大的景深非共可容納滑動面的變化，以確保準(zhǔn)確的集光，在整個掃描區(qū)域。微陣列的光學(xué)平面幻燈片市售。這些幻燈片的額外投資可能還清生產(chǎn)更多的可重復(fù)性的結(jié)果和更少的反復(fù)實驗。

　　儀器的子系統(tǒng)，如支持的滑動表面，在成像過程中，控制樣品的運(yùn)動和/或激發(fā)源的組件，以及照明和收集光學(xué)場的均勻性都可以影響。在激光和白光的系統(tǒng)中，所有這些組件都必須精確地指定和對齊，以確保均勻的照明，在樣品表面上的所有點(diǎn)處。

　　場均勻性的理想的標(biāo)準(zhǔn)來評價。將一個光學(xué)平面的滑動，被均勻地涂覆有一個穩(wěn)定的熒光材料的薄膜。然而，為了描述正確的均勻分布的一種儀器，測試標(biāo)準(zhǔn)本身有更均勻的問題，以便不貢獻(xiàn)其自己的非均勻性的測量儀器。盡管薄膜涂層技術(shù)是不是新的，所需要的均勻，穩(wěn)定，熒光信號在顯微鏡幻燈片格式的標(biāo)準(zhǔn)尚未確定。

　　可以做一個合適的替代試驗與任何熒光芯片。只需掃描陣列在一個方向，旋轉(zhuǎn)180度，再次掃描，并比較相同點(diǎn)的信號強(qiáng)度在每個掃描。在第二次掃描的一貫較低的信號表明漂白。在任一方向的第三個掃描可以用來量化的漂白和減去其貢獻(xiàn)的均勻分析。這種旋轉(zhuǎn)測試場的均勻性是最可靠的措施，利用現(xiàn)有的工具。然而，它是有限的，是不對稱的，相對于旋轉(zhuǎn)的變化。例如，統(tǒng)一的山坡或山谷中間的幻燈片可能被發(fā)現(xiàn)。

　　圖4。重復(fù)性測試GenePix的4000B。一個穩(wěn)定的重復(fù)掃描熒光塑料材質(zhì)，每天四次六天（紅色通道，綠色通道500 V 700 V）。從幻燈片上的一個固定區(qū)域的信號的強(qiáng)度，計算相對熒光單位（RFU）。所有掃描之間的差異為1.6％，綠色通道和紅色通道的2.1％。誤差棒涵蓋從四個測量值的平均值的兩個標(biāo)準(zhǔn)devations（點(diǎn)擊放大）。

　　從一個單一的芯片實驗重現(xiàn)性。不能得出有意義的生物結(jié)論。用戶是否有資源創(chuàng)造無限的自己設(shè)計的陣列，或購買預(yù)制陣列的，可重復(fù)的結(jié)果的數(shù)量減少昂貴的實驗重復(fù)須制定統(tǒng)計學(xué)和生物學(xué)意義的結(jié)論。要確?？芍貜?fù)的結(jié)果，用戶必須首先遵守推薦的預(yù)熱時間和他們的儀器操作條件。特別是，激光器和白色光源需要的時間來穩(wěn)定。此外，電子部件和運(yùn)動部件可以容易受到極端溫度和濕度的影響。

　　微陣列成像系統(tǒng)的輸出信號的再現(xiàn)性，通過掃描一個穩(wěn)定的熒光標(biāo)準(zhǔn)隨著時間的推移在相同的掃描儀設(shè)置（參見圖4），不可避免的長期信號漂移的最佳保險施加如上述的校準(zhǔn)程序，可以進(jìn)行測試。短期掃描到掃描的重現(xiàn)性，也可以測試與任何合理穩(wěn)定的熒光樣品，但由于光漂白的任何信號劣化，必須測量中減去。

　　結(jié)論

　　各個組件的規(guī)格使制造商能夠定義他們所尋求的性能水平。然而，任何樂器的表現(xiàn)不取決于這些規(guī)格，但其整合成一個完整的系統(tǒng)功能。在微陣列的成像系統(tǒng)中，組件的質(zhì)量，??設(shè)計的光學(xué)和電子學(xué)，和對應(yīng)的所有元素確定最終圖像的質(zhì)量，定量精度和重現(xiàn)性。仔細(xì)定量從相同的樣品的圖像準(zhǔn)確地比較不同的成像系統(tǒng)是唯一的方法。芯片界目前缺乏強(qiáng)大的定量測試標(biāo)準(zhǔn)評估關(guān)鍵的性能參數(shù)，必須湊合著用有限的替代品。行業(yè)領(lǐng)導(dǎo)者正在與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所（NIST）合作設(shè)計和開發(fā)熒光芯片測試標(biāo)準(zhǔn)。這些NIST可追蹤工具將使制造商能夠達(dá)到新的水平卓越的芯片掃描儀設(shè)計。

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