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| | HRP的催化反應(yīng)需要底物過氧化氫和供氫體 | |
      
凡無毒性又能呈現(xiàn)有色化學(xué)反應(yīng)的酶,原則上均可作為標(biāo)記用。但作為標(biāo)記抗體用的酶應(yīng)滿足下列要求:(1)來源方便,易于純化;(2)比活性高,性質(zhì)穩(wěn)定;(3)酶活性和量能用簡單方法測定。目前在免疫酶技術(shù)中常用的酶為辣根過氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP),其次還有葡萄糖氧化酶,β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。
由于辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高,穩(wěn)定,分子量小,純酶容易制備,所以最常用。HRP廣泛分布于植物界,辣根中含量高,它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白,糖含量18%。HRP由多個(gè)同功酶組成,分子量為40,000,等電點(diǎn)為PH3~9,酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異,但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm,一般以O(shè)D403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右(最高可達(dá)3.4)。RZ值越小,非酶蛋白就越多。值得注意的是,純度并不表示酶活性,如當(dāng)酶變性后,RZ值仍可不變。
HRP的催化反應(yīng)需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型染料,通過反應(yīng)可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應(yīng)的過程如下:
HRP
DH2+H2O2────→D+2H2O
供氫體的種類很多,形成的產(chǎn)物特點(diǎn)不一。如DAB(3.3-二氨基聯(lián)苯胺)的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀物,并有電子密度,故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。5AS(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA,但其溶解度不夠大,且空白孔不易控制到無色,現(xiàn)已很少應(yīng)用。OT(鄰聯(lián)甲苯胺)的特點(diǎn)是能產(chǎn)生鮮艷的藍(lán)綠色產(chǎn)物且靈敏度較高,但反應(yīng)中受溫度影響較大,而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定,需要在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是:OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色,后者產(chǎn)物為藍(lán)綠色,二者的可溶性均好,在避光處顏色穩(wěn)定,空白可近于無色,靈敏度上據(jù)報(bào)道后者比前者可高4倍以上。另外,還有一種供氫體稱ABTS[2, 2'-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)],其反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)綠色,且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面,ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。
由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑,因此酶促反應(yīng)中使用的H2O2不能過量。應(yīng)控制在經(jīng)較短時(shí)間反應(yīng)后呈色即達(dá)高峰(說明H2O2已消耗殆盡)。這樣即使再延長時(shí)間也不會增加反應(yīng)產(chǎn)物的顏色。
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