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| 自動圖像分析技術提供標準化和定量測量 | |||
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在一個典型的AQUA實驗測量靶基因表達于上皮性癌，4'-6-二脒基-2 - 苯基用于核掩模（UV通道），抗細胞角蛋白抗體識別和區(qū)分上皮細胞基質(zhì)（腫瘤掩模，用于），并建立了細胞質(zhì)面具（CY2和/或Cy3的通道），以及針對目標的抗體用于可視化的靶基因的蛋白表達興趣（Cy5和/或CY7通道）。然而，AQUA實驗并不限于這些參數(shù)。根據(jù)不同的組織/車廂希望的掩模，實驗中采用了一些不同的掩蔽標記。例如，在GBM的研究的情況下，神經(jīng)元細胞，膠質(zhì)纖維酸性蛋白可以用于定義一個遮蔽區(qū)域。
一旦組織已適當染色，圖像采集可以繼續(xù)使用PM2000系統(tǒng)HistoRx公司。PM2000平臺是一個自動落射熒光顯微鏡與隨附AQUAsition的圖像采集軟件系統(tǒng)，是專為高分辨率自動化組織芯片和整個組織切片的圖像采集。
，AQUA得分的基礎是基于像素的區(qū)域設置分配條塊的表達（位置）的圖像分析算法。4組織是一種復雜的混合物中的各種組織成分（即，上皮細胞，間質(zhì)，血管）和亞細胞成分（即，細胞質(zhì)，細胞核，膜）。地方使差分圖像像素強度本地化相關的靶基因的表達，在這些不同的組件或口罩。在傳統(tǒng)的AQUA軟件，通過一系列的像素的強度閾值的步驟定義的掩模，產(chǎn)生二進制圖像，然后通過圖像排除的步驟（參見圖2）。在下一代軟件中，將被隔離的執(zhí)行在一個完全無監(jiān)督的方式，使用簡單的數(shù)學算法。
水族圖像分析。的Aqua分析過程中的示意性表示一個典型的實驗中，看著上皮癌中的生物標志物的表達。（1）通過像素強度閾值（二進制門控）和空間圖像分析程序生成腫瘤面具。（2a和2b）代細胞質(zhì)和細胞核特定像素面膜通過二進制澆注。（3）結合細胞質(zhì)和細胞核特定像素口罩100％相互排斥。（4）確定巧合的目標像素與車廂像素（僅供可視）（點擊圖片放大）。
AQUA分析概述在圖2中，還提供了一個一步一步的插圖AQUA圖像分析來完成給定的一個典型的實驗，例如使用目標的雌激素受體 ??（ER）與上皮腫瘤。同樣，這AQUA分析可以被應用到不同的排列，這取決于應用程序。
AQUA分析通過像素強度閾值（二進制選通）和空間的圖像分析程序（即，填充孔，參見圖2a和c）通過產(chǎn)生腫瘤掩模的開始。確定腫瘤掩模像素作為模板，使用相同類型的像素強度閾值是用來識別細胞核和/或細胞質(zhì)像素（參見圖2d和e）。通過100％的互斥的處理，這些圖像組合，以提供像素分配條塊（參見圖2f）。AQUA得分產(chǎn)生，它代表的像素的濃度的目標像素強度/隔室面積的總和。為了可視化的目的，步驟4在圖2中示出的目標圖像的重疊（顏色為紅色）隔室ER的細胞核（在紅色與藍色的核從覆蓋的目標像素的品紅圖象展示共定位;圖2小時）。
標準化由于IHC傳統(tǒng)的主觀和定性，跨實驗室和觀察員的標準化是有問題的。由于AQUA技術是客觀和嚴格定量的，也可以是標準化，儀器，實驗室，和運營商。HistoRx公司已開發(fā)的儀器校準方法，使多個儀器上捕獲的信號進行歸。11這種標準化是通過光源和內(nèi)在機校準方法的組合。這些方法是自動化和使用穩(wěn)定的非生物材料，主校準完成實時數(shù)據(jù)采集。
軟件算法的方法已經(jīng)被發(fā)展為主要刪除操作員決定從圖像采集（即，自動曝光）和得分的過程（即，無監(jiān)督聚類的基于像素的）10在這些方法也可以被應用到任何目標實現(xiàn)的CV還小于5％，這是與其它定量免疫測定法（例如，酶聯(lián)免疫吸附，流式細胞儀）相媲美。此外，這些標準化方法已應用到眾多的標記，包括mTOR的HER2，EGFR，ER和PTEN 10,11。
開發(fā)臨床診斷的重要的是能夠再現(xiàn)病人分類。例如，目前的ASCO-CAP指南建議，實驗室應達到95％的正/負目前HER2檢測方法的一致性，12最近的一項研究表明，對于HER2蛋白的得分，介于54％至85％之間的一致性實驗室，這些準則低于13正/負一致性檢查工具，跨運營商，和染色天AQUA得分。整體一致性從94.5％到99.3％不等。
這些分析包括所有案件，包括那些將被視為模棱兩可的標準IHC方法，并會受到反折到一個不同的方法（即熒光原位雜交）。因此，AQUA分析可以得到一個標準化的蛋白表達得分與一個單一的方法以獲得更多的樣品，同時仍然允許維持典型的病理實驗室的工作流程提供了一個平臺。
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