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		直接和間接ELISA各種類型的ELISAs

　　ELISAs可以分為直接的和間接的方法。在一個(gè)直接ELISA,測(cè)定組件綁定到固體表面與酶標(biāo)記二分析組件。一般來(lái)說(shuō),直接ELISAs并不廣泛使用,作為標(biāo)記的抗原或抗體的主要耗時(shí)又昂貴。

　　在一個(gè)間接ELISA,檢測(cè)是進(jìn)行一個(gè)酶標(biāo)記二次抗體。首先,一個(gè)初級(jí)抗體與抗原。在第二個(gè)孵化一步,一個(gè)標(biāo)記二次抗體能識(shí)別主要抗體是用。如果初級(jí)抗體來(lái)自同一物種被用在不同的化驗(yàn),相同的酶標(biāo)記二次抗體可以用于檢測(cè)。此外,靈敏度增加幾個(gè)二級(jí)抗體可以綁定到一個(gè)主要抗體,導(dǎo)致信號(hào)放大。各種各樣的標(biāo)記二次抗體是商業(yè)上可用。

　　三明治或捕獲ELISA。當(dāng)抗原不能被直接綁定到固體表面的分子,因?yàn)樗麄兊膶傩?一個(gè)三明治使用ELISA。固體表面上涂上一種特定抗體用于捕獲抗原。因此,一個(gè)三明治ELISA有時(shí)被稱為一個(gè)捕獲ELISA。在第二次免疫反應(yīng),另一種特定抗體是補(bǔ)充說(shuō),監(jiān)測(cè)到一個(gè)酶標(biāo)記二次抗體。因此,抗原抗體之間的綁定兩個(gè)。對(duì)于一個(gè)三明治ELISA、抗原必須包含至少兩個(gè)抗原,它允許并行綁定兩個(gè)抗體。

　　競(jìng)爭(zhēng)性ELISA。如果分析物也太小了綁定兩個(gè)不同的抗體或如果只有一個(gè)特定的抗體可用,一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)ELISA可能是首選的分析格式。在一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)ELISA、標(biāo)記和預(yù)滴定測(cè)定組件添加同時(shí)與樣品。如果抗原被綁定到固體表面,然后混合樣品和添加標(biāo)記抗體在孵化的一步。包含在樣本的抗體和酶標(biāo)記抗體對(duì)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。更包含在樣本的抗體,酶標(biāo)記抗體可用少與抗原涂層。減少的綁定標(biāo)記抗體的結(jié)果在一個(gè)下降的信號(hào)。另外,抗體可以綁定到表面,然后添加標(biāo)記抗原與抗原競(jìng)爭(zhēng)包含在樣本在免疫反應(yīng)。

　　間接ELISA協(xié)議。下面的測(cè)試協(xié)議描述了一種間接ELISA在96孔聚苯乙烯高綁定微板塊,基于吸附綁定的胰島素的內(nèi)表面井和隨后的互動(dòng)與一個(gè)特定的綁定胰島素單克隆抗胰島素抗體。檢測(cè),一個(gè)反鼠標(biāo)IgG-HRP共軛是使用。

　　涂層。井充滿了100?l涂料解決方案(800 ng / ml的胰島素在0.05 M碳酸鹽緩沖;pH值9.6)和存儲(chǔ)在一個(gè)孵化器一夜之間(約18小時(shí))在23°c。為了避免蒸發(fā),培養(yǎng)皿中都充滿了水,放在孵化器。另外,這些盤子可以密封與板密封材料。

　　洗滌。培養(yǎng)后,盤子都洗了四次350?l pbs t緩沖區(qū)(0.14 M氯化鈉;0.01警察丁;0.05%二層20;pH值7.4)/好。在最后一次洗滌步驟,液體完全被敲了板到紙毛巾。

　　阻塞。未綁定的網(wǎng)站被屏蔽在表面與BSA的結(jié)合,避免在后續(xù)測(cè)定步驟。抗體這些板塊都充滿了150?l /好阻止溶液(3% BSA在pbs t)和孵化60分鐘的23°c .培養(yǎng)后,解決方案是手傾析。剩下的液體被敲了板到紙毛巾。

　　添加主要抗體。在免疫化學(xué)反應(yīng)、抗胰島素抗體(初級(jí)抗體)添加和綁定的胰島素分子上。這些板塊都充滿了100?l /好初級(jí)抗體溶液(80 ng / ml單克隆抗胰島素抗體鼠標(biāo)在pbs t)和在23°C孵化為60分鐘。

　　洗滌。飄散的抗體被沖走在隨后的洗滌程序(重復(fù)洗滌步驟上面所描述的)。

　　增加二次抗體。之間的相互作用檢測(cè)胰島素和特定的抗體,抗小鼠IgG-HRP共軛(二次抗體)使用。這些板塊都充滿了100?l /良好的二次抗體溶液(300 ng / ml的抗小鼠免疫球蛋白g antibody-HRP共軛在pbs t)。這些板塊都在23°C孵化為60分鐘。

　　洗滌。重復(fù)洗滌步驟上面所描述的。

　　檢測(cè)。這些板塊都充滿了100?l /的襯底溶液(其中一部分3,3′,5,5’-tetramethylbenzidine(TMB)三個(gè)部分的檸檬酸/醋酸,每0.1米;pH值4.9)和在23°C的孵化20分鐘。TMB被HRP,和一個(gè)藍(lán)色的顏色被釋放。這個(gè)比色反應(yīng)是停止和固定通過(guò)添加100?l 0.5米硫酸/嗯,這改變了藍(lán)色的顏色黃色。強(qiáng)度的反應(yīng)和合成顏色是衡量一個(gè)微型板塊讀者在450海里。顏色是穩(wěn)定的最多一個(gè)小時(shí),和板應(yīng)該在此時(shí)間段內(nèi)測(cè)量。

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