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| 膜厚度和血紅蛋白結(jié)合位點的數(shù)量影響最小樣本 | |||
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測試樣品可以毛細血,靜脈抽血的抗凝劑(通常EDTA),冷凍靜脈血畫在抗凝、和控制。 使用原型系統(tǒng),85μL第一緩沖和55μL第二緩沖足以執(zhí)行漂洗。 檢測時間是大約五分鐘。 在添加第一個緩沖區(qū)和閱讀濕帶空白,太長時間的延遲增加血液可以讓太多的緩沖區(qū)傳遞,沖洗將不完整。 因此,血液樣本應(yīng)該添加在15秒的讀取濕帶反射。 時間的添加第二個緩沖區(qū)不是關(guān)鍵的檢測方法提供了許多優(yōu)點,包括以下:
在離子綁定步驟的分析,不僅超額血紅蛋白是通過帶但也沖洗其他不具約束力的元素在血液樣本。 這就消除了可能的干擾物質(zhì)從測量前區(qū)反射率測量是由。
血紅蛋白綁定第一緩沖區(qū)將非糖化和糖化血紅蛋白數(shù)量比例濃度在示例。 因此,改變數(shù)量的血紅蛋白綁定第一緩沖區(qū)將導致一個比例變化在糖化血紅蛋白綁定與第二緩沖。 變化總血紅蛋白測量因此平行于糖化血紅蛋白的變化測量。 使用的比率來計算糖化血紅蛋白總量%糖化血紅蛋白變化的影響消除。 脫到帶變化由于組件和制造差異因此最小化。 這在圖2中可以看到,它顯示來自多個化驗結(jié)果相同的樣本。 濃度的變化總血紅蛋白綁定在不同測定法是平行的濃度變化糖化血紅蛋白。 結(jié)果的精度提供了在圖2中說明的不精確比率是一個很多小于將預測從總和糖化血紅蛋白測量不精確,如果這兩個都是完全獨立的。
兩個總和糖化血紅蛋白測定在同一位置的矩陣使用相同的光源和探測器。 兩次測量之間的差異最小化,從而提高分析精度。膜是由只有共價束縛,帶負電荷的羧基和boronate組和不包含任何不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)或標記化合物。 膜本身是穩(wěn)定不制冷,這使得它非常適合發(fā)展中國家使用。膜是測定唯一的活性組分,可以合并到一個數(shù)量的設(shè)計,可以是簡單和廉價的,或更復雜的。
演示技術(shù)的可行性來衡量%糖化血紅蛋白,它被納入一個簡單的試驗系統(tǒng)。 檢測系統(tǒng)的組成包括緩沖區(qū)(pH值6.5),緩沖B(pH值9.5),測試帶,它存儲在一個干的
(硅膠)瓶,一個涂布方便添加樣品線的跨膜、手持系統(tǒng)的血糖計式反射計(名義430 nm領(lǐng)導;見圖3)。測試條夾在表包含一個井被放置在結(jié)束時的膜帶插入。 緩沖區(qū)被添加到這個好,流進膜。 測試條持有人還設(shè)計有插槽將兩條腿的涂布和正確定位線包含樣本到膜。
一個Porex橫向弗洛膜與添加boronate團體準備如上所述,用于測試條的設(shè)計,利用橫向流性質(zhì)的膜(見圖4)。膜坐落在一個塑料支架,反光層謊言在閱讀區(qū),吸收劑的緩沖和沖洗水槽收集血液。 緩沖區(qū)被添加的一端膜通過油井計,和血液樣品添加只是下游的緩沖區(qū)。 緩沖移動樣品通過膜到水槽在另一端。 綁定發(fā)生在整個膜,反射測試所使用的應(yīng)用程序之間血液網(wǎng)站和水槽從一個洞里塑料支架。
組裝測試帶作為卡使用手冊紋理過程。 絲帶的不同組件被放置在塑料基板,這是預涂有粘合劑和預穿孔有破洞。 組件一起舉行使用層的雙貼膠帶。 每個卡片生產(chǎn)50測試帶,減少信用卡使用切紙機。 批次的5000測試帶的都是用這個過程。
在原型系統(tǒng)分析,計測量反射率的總血紅蛋白和糖化血紅蛋白如上所述。 這些反射測量轉(zhuǎn)換為血紅蛋白濃度,并計算出糖化血紅蛋白占總比率。 這個比率轉(zhuǎn)換為參考%糖化血紅蛋白值通過標準化比率%的結(jié)果參考法糖化血紅蛋白。 參考方法用于研究下面描述的是一個boronate親和力的高效液相色譜法都有其%的糖化血紅蛋白檢測結(jié)果標準化的糖尿病控制和并發(fā)癥試驗(DCCT)。
反射率和濃度之間的關(guān)系是非線性的,是由實驗決定的類型的膜被使用。 樣品用不同的血紅蛋白濃度是通過膜條件下沒有血紅蛋白結(jié)合。 反射率測量是為每個濃度的樣品流經(jīng)測量面積。 濃度與反射率數(shù)據(jù)都配有一個四參數(shù)邏輯方程。 這個方程將反射率測量在試驗(如。 ,在點A和B在圖1)對應(yīng)的血紅蛋白濃度值。
糖化血紅蛋白濃度(B點測量)除以總血紅蛋白濃度(點測量)獲得糖化血紅蛋白,血紅蛋白總量比例。 這個比率是線性相關(guān)的糖化血紅蛋白濃度測定的參考方法(參見圖5)。圖5顯示了從多個分析獲得的數(shù)據(jù)的五個病人的血液樣本。 這種線性關(guān)系(斜率和截距)轉(zhuǎn)換比率來引用%糖化血紅蛋白值。
技術(shù)的性能進行了研究使用原型系統(tǒng)。 這項研究包括比較分析結(jié)果參考方法,測量測定精度,確定測定線性,確定使用溫度應(yīng)力試驗片的穩(wěn)定性。結(jié)果從化驗血樣使用原型系統(tǒng)的分析比較結(jié)果相同的樣品使用NGSP二級參考方法。 提供了一種方法標準化NGSP糖化血紅蛋白檢測結(jié)果,建立了兩個研究糖化血紅蛋白濃度之間的關(guān)系和長期問題在糖尿病患者:DCCT和英國前瞻性糖尿病研究表明)。 NGSP集的標準比較測試結(jié)果從新技術(shù)參考方法測試結(jié)果,基于偏差之間的兩組結(jié)果。 測試方法是在滿足認證標準。
凍全血樣品從四十患者獲得來自密蘇里大學的,一個主要的參考實驗室NGSP。 這些樣本化驗的boronate綁定高效液相色譜法,使用作為一個次要NGSP參考方法。 然后他們被重復使用中化驗原型系統(tǒng)。 樣品的范圍從5%到11%的糖化血紅蛋白糖化血紅蛋白,與9之間5%和6%,七6%和7%之間,和二十四在7%和11%之間。
最小二乘法回歸分析的結(jié)果從化驗使用原型系統(tǒng)與參考方法的結(jié)果給了一個回歸公式,Y = 1.21 X - 0.12,Y是原型糖化血紅蛋白和糖化血紅蛋白X是參考。 統(tǒng)計分析表明,邊坡是1(P = 0.394)和攔截是0(P = 0.397)。 相關(guān)系數(shù)R2為0.971,表明%糖化血紅蛋白結(jié)果使用原型試驗證明一個好相關(guān)的結(jié)果使用的參考方法。 圖6顯示了偏壓情節(jié)原型之間的化驗結(jié)果和參考方法測定結(jié)果。 95%的置信區(qū)間范圍的偏差結(jié)果落在2011 NGSP標準認證的可跟蹤性,研究結(jié)果表明DCCT。
原型系統(tǒng)的精度測量結(jié)果的多個化驗的靜脈血樣本(儲存在4°C),它是由兩個運營商使用兩個很多帶了兩天。 每個操作員每天跑八化驗對每個批次(32總化驗對每個批次)。 總體結(jié)果一是意味著很多% 5.2的糖化血紅蛋白與3.1%的簡歷。 結(jié)果兩人一個意味著很多5.4的糖化血紅蛋白與% 2.8%的簡歷。 一個雙向方差分析的數(shù)據(jù)顯示沒有統(tǒng)計上顯著的日常變化(P = 0.238)或操作員算子變異(P = 0.238)。
線性度的測定是證明了結(jié)果的分析外加劑的正常和高架控制。 結(jié)果證明了分析有一個線性響應(yīng)到至少16%的糖化血紅蛋白和精度是一致的在線性范圍(見表)。
膜的穩(wěn)定性是決定通過將測試條雖然一個加速老化過程和存儲他們處于高溫45°c(早先的研究表明,離子的結(jié)合血紅蛋白的膜是影響膜的接觸到75%相對濕度持續(xù)一段時間。 測試條因此儲存在封閉瓶含有硅膠干燥劑)。 化驗的靜脈血樣本,在aliquots冷凍貯藏進行在不同存儲間隔和使用一個新瓶每個時間。 測試帶,被儲存在室溫下也用于測定血液在每個存儲間隔作為控制可能的變化隨著時間的血液樣本。 圖7提供了糖化血紅蛋白測定結(jié)果的百分比不同存儲間隔為兩套帶。
比一天零結(jié)果,分析結(jié)果證明沒有證據(jù)表明在45°測試條衰減測量糖化血紅蛋白C %至少365天。 測試條45°C提供存儲在相同的結(jié)果作為室溫存儲條在每個存儲間隔。 結(jié)果從這些化驗還顯示,沒有腐爛在總血紅蛋白綁定或糖化血紅蛋白綁定在要么溫度為365天。 這證明了帶負電荷的團體和boronate團體保持它們的功能在兩個期間的溫度貯存時間。
初步結(jié)果表明,血紅蛋白測試可能的干擾物HbAE變體,廣告,交流,因為,膽紅素、脂血化驗結(jié)果沒有改變。 預計將會有小的干涉,因為大多數(shù)洗血的成分通過閱讀區(qū)域進行采樣測量之前。 化合物不僅必須綁定但也吸收光線的測量波長為了干擾直接。 此外,任何降低綁定的總血紅蛋白會相應(yīng)減少并行降低糖化血紅蛋白由于使用的比率來計算%糖化血紅蛋白。
結(jié)論
使用所述綁定技術(shù),它有可能開發(fā)出一種低成本的糖化血紅蛋白的檢測系統(tǒng)。 該系統(tǒng)可以利用手持反射儀測量。 的化學修飾膜是穩(wěn)定的,它允許系統(tǒng)有足夠的穩(wěn)定,不制冷。 因此,可以開發(fā)一個相對低成本的系統(tǒng),可以用于在發(fā)展中國家。 這項技術(shù)也可以被納入更復雜的系統(tǒng),即時使用。
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