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| 實(shí)驗(yàn)裝置化學(xué)發(fā)光測(cè)定法實(shí)現(xiàn)的測(cè)量 | |||
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實(shí)驗(yàn)裝置對(duì)PS-阿托工作試劑的制備以1:1的比例相結(jié)合，兩種解決方案。一系列10倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶的Biozyme實(shí)驗(yàn)室國(guó)際有限公司（圣地亞哥）用水稀釋。發(fā)光從PS-阿托與HRP反應(yīng)的時(shí)間過(guò)程，評(píng)估重復(fù)的100微升等分試樣的工作試劑反應(yīng)3.5?10-16摩爾的HRP在25℃下 光照強(qiáng)度記錄在任何一個(gè)設(shè)計(jì)公司（桑尼維爾，CA）特納 TD 20E光度計(jì)提供一個(gè)中性密度濾光片，光強(qiáng)度或熱Labsystems（富蘭克林，MA）Luminoskan微孔板發(fā)光衰減。除非特別注明，所有的化學(xué)發(fā)光測(cè)量是在室溫下進(jìn)行。
化學(xué)發(fā)光峰強(qiáng)度的關(guān)系的HRP量測(cè)定反應(yīng)，一式三份PS-阿托和TMA-6分別與HRP溶液中制備的取值范圍為1.4的10μl的工作溶液的100微升等分試樣10-16日?qǐng)A1.4?10-21摩爾。隨后光發(fā)電混合時(shí)，迅速達(dá)到最大強(qiáng)度。光強(qiáng)度的記錄，6分鐘混合后，在任何一個(gè)TD 20e的螢光光度計(jì)或Luminoskan 96 - 孔板的發(fā)光計(jì)。（本文中給出的強(qiáng)度測(cè)量，數(shù)字和表格是在相對(duì)光單位RLU）。
PS-阿托TMA-6存儲(chǔ)穩(wěn)定性超過(guò)1年的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行評(píng)估。工作溶液和單獨(dú)構(gòu)成的解決方案的樣品貯存于4℃，室溫和40℃下在棕色不透明的聚乙烯瓶中。等分被撤銷(xiāo)的時(shí)間間隔和分析的背景發(fā)光和發(fā)光峰值3.5?10-16摩爾HRP在25°C。百分比剩余活性測(cè)定比較，與對(duì)照樣品貯存于4℃。后者獨(dú)立沒(méi)有表現(xiàn)出改變的信號(hào)強(qiáng)度超過(guò)一年的存儲(chǔ)分離的組件解決方案。
表一HRP量使用PS-阿托化學(xué)發(fā)光檢測(cè)或TMA-6（點(diǎn)擊放大）發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系。甲測(cè)試抗原??，β-半乳糖苷酶和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體的Western blot分析進(jìn)行使用硝酸纖維素膜和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)TMA-6，5000的范圍內(nèi)，在與β-半乳糖苷酶的標(biāo)準(zhǔn)5皮克。短暫孵育印跡與試劑，排出過(guò)量的試劑，并在2小時(shí)的過(guò)程，潮濕的印跡與X射線膠片成像。
結(jié)果對(duì)PS-阿托檢測(cè)試劑由PS-阿托底物化合物（參見(jiàn)圖3a）中的緩沖溶液中含有酚性增強(qiáng)劑，過(guò)氧化氫，和其他專(zhuān)有組件以獲得最佳的分析性能。TMA-6類(lèi)似的配方中含有過(guò)氧化物酶的底物化合物（參見(jiàn)圖3b）。
圖6。TSH酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)使用的的科瓦斯核心免疫檢測(cè)試劑盒（羅氏）的組成部分。發(fā)光檢測(cè)采用PS-阿托。二次抗體結(jié)合物稀釋2倍，以提高信號(hào)相對(duì)于背景。比色法數(shù)據(jù)來(lái)自包鑲（點(diǎn)擊放大）。
對(duì)PS-阿托基板與辣根過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫的氧化作用被認(rèn)為是產(chǎn)生二氧環(huán)乙烷中間體，隨后片段，以產(chǎn)生處于激發(fā)態(tài)的吖啶酮（參見(jiàn)圖4）。反應(yīng)所發(fā)射的光的跨越約400-550納米的區(qū)域中，與極大值，在430和445 nm。的頻譜匹配的熒光光譜N-benzylacridone的。TMA-6與HRP的氧化涉及到一個(gè)類(lèi)似的機(jī)制，發(fā)射極為N-phenylacridone的。最大化學(xué)發(fā)光的PS-阿托幾乎是相同的。
PS-阿托或TMA-6試劑與HRP的反應(yīng)混合后立即產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光發(fā)射。最大強(qiáng)度達(dá)到幾秒鐘后，在室溫下和在反應(yīng)過(guò)程中保持恒定強(qiáng)度的幾分鐘（參見(jiàn)圖5）。高原反應(yīng)的HRP與PS-阿托化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系的酶的量超過(guò)至少4個(gè)數(shù)量級(jí)，如示于表Ⅰ的曲線的斜率是由方程描述 Y = 0.931x + 18.689，R2 = 0.999。類(lèi)似的動(dòng)態(tài)范圍的HRP定量測(cè)定時(shí)的反應(yīng)均在25℃和37℃下，使用PS-阿托。（數(shù)據(jù)未示出）測(cè)量的動(dòng)態(tài)范圍TMA-6，并沒(méi)有延伸到盡可能低的水平，使用的條件下，與PS-阿托。
活性的PS-阿托工作后各個(gè)時(shí)期的存儲(chǔ)保持的解決方案，在4℃下或房間的溫度（a）中所占的百分比TMA-6工作溶液的活性的能力，后各個(gè)時(shí)期的存儲(chǔ)保持在4的容量百分比°C（B）。活動(dòng)表示新鮮制備的組件單獨(dú)保存在4℃（點(diǎn)擊放大）對(duì)照樣品。極端的檢測(cè)靈敏度允許的發(fā)展高度敏感的酶免疫測(cè)定。與PS-阿托化學(xué)發(fā)光檢測(cè)ELISA試劑盒的cobas核心商業(yè)促甲狀腺激素（TSH）由羅氏（巴塞爾，瑞士），它采用比色法檢測(cè)抗體-HRP偶聯(lián)物，被修改。比色法報(bào)價(jià)0.05 MIU / L，檢測(cè)限為提供的最低標(biāo)準(zhǔn)是1 MIU / L。共軛雙重稀釋和PS-阿托代檢測(cè)試劑，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法適合。標(biāo)準(zhǔn)稀釋至0.003 MIU / L。
此化學(xué)發(fā)光測(cè)定法實(shí)現(xiàn)的測(cè)量，0.003廟/ L（見(jiàn)圖6）。的信號(hào)的最低的校準(zhǔn)器，20.5±2.3 RLU，大大超過(guò)了空白10.2±2.3 RLU，所以計(jì)算出的檢出限的檢測(cè)實(shí)際上是有點(diǎn)低。此值不表示為了充分優(yōu)化的檢測(cè)，然而，測(cè)量化學(xué)發(fā)光綁定手動(dòng)試管格式的在聚合物珠粒的表面的試劑時(shí)，分析的靈敏度受到不利的影響。
為了評(píng)估的試劑的穩(wěn)定性PS-阿托和TMA-6的工作解決方案，這些解決方案相結(jié)合，這兩個(gè)組件的50微升等分試樣和存儲(chǔ)的混合物在4℃下，并在室溫制備。3.5?10-16摩爾HRP化學(xué)發(fā)光檢測(cè)運(yùn)行在25°C 這些測(cè)量是比獲得的值分別存儲(chǔ)在4℃下用新鮮制備的試劑從組件 結(jié)果顯示：在貯存試劑的性能沒(méi)有劣化，在室溫下?3周。PS-阿托不變，4個(gè)月后，在4℃，TMA-6和9個(gè)月后在該溫度下保持不變（參見(jiàn)圖7）。
在另外的實(shí)驗(yàn)中，含有過(guò)氧化物酶底物的溶液成分在室溫下孵育，并在40℃下了數(shù)個(gè)月。結(jié)合的第二成分和上述測(cè)定得到的工作溶液的等分試樣。與使用新鮮配制的溶液，從組件分開(kāi)存放在4℃下所獲得的結(jié)果進(jìn)行了比較 沒(méi)有可檢測(cè)到的信號(hào)的變化，觀察到在工作解決方案，無(wú)論是從襯底制備試劑分開(kāi)存儲(chǔ)長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月，在40℃下，在室溫下或1年。
與過(guò)氧化物酶結(jié)合的抗體和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)TMA-6蛋白抗原的Western blot法檢測(cè)的β-半乳糖苷酶的抗原檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行?？乖磕繛?皮克5納克。物L(fēng)umigen PS-3和最敏感的商業(yè)魯米諾試劑ECL +硝酸纖維素膜（Amersham Biosciences公司，英國(guó)Amersham）進(jìn)行了比較。TMA-6的檢測(cè)限低至或低于目前使用的最敏感的試劑。背景發(fā)光控制良好，足以讓低皮克數(shù)量的抗原檢測(cè)。所有的抗原的水平檢測(cè)到在從10分鐘至2小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)（參見(jiàn)圖8）。
圖8。西方涂抹圖片TMA-6采用5秒曝光用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)β-半乳糖苷酶。印跡證明皮克靈敏度超過(guò)2小時(shí)的時(shí)間內(nèi)，A = 5000，B = 1000 PG，PG C = 180皮克，D = 30 PG，和E = 5皮克。描繪的時(shí)間點(diǎn)是：（一）第11分鐘，及（b）120分鐘（點(diǎn)擊放大）。
TMA-6工作解決方案的長(zhǎng)期穩(wěn)定提供了進(jìn)一步的措施，進(jìn)行了超過(guò)1年期間通過(guò)串行Western印跡檢測(cè)。印跡協(xié)議的性能比較上述被描繪（見(jiàn)圖9），使用新鮮與1歲的TMA-6工作解決方案。結(jié)果表明減值印跡檢測(cè)靈敏度。
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