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		過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化物酶結(jié)合物化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

　　物L(fēng)umigen PS-阿托TMA-6是新的過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化物酶結(jié)合物化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑。每個(gè)這些試劑的試劑溶液制備按將兩種水溶液以1:1的比例相結(jié)合，并包含專有的基板，過(guò)氧化氫 ??，和增強(qiáng)子在緩沖溶液。的過(guò)氧化物酶與試劑的反應(yīng)非常迅速產(chǎn)生的峰值光強(qiáng)度。與目前使用的基于魯米諾試劑，這些積累基本上沒(méi)有涉及排放峰值時(shí)間。

　　高原強(qiáng)度的發(fā)展，在實(shí)驗(yàn)中，光測(cè)量的精確定時(shí)是不必要的，用于確定光強(qiáng)度對(duì)酶量的依賴性。光的強(qiáng)度是足夠的，使檢測(cè)10-20摩爾的HRP在6分鐘的測(cè)定與PS-阿托和10-19摩爾TMA-6的兩倍以上使用極限的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的信號(hào)的空白空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差（見(jiàn)表I）。日志日志積光強(qiáng)度與HRP在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)10-16-10-20摩爾摩爾展出了高線性度。據(jù)預(yù)計(jì)，分析精度和動(dòng)態(tài)范圍將得到改善，從更大數(shù)量的復(fù)制具有更寬的動(dòng)態(tài)范圍的測(cè)量?jī)x器上的數(shù)據(jù)加以收集。

　　圖9所示。圖像比較西方涂抹新鮮制備β-半乳糖苷酶檢測(cè)化學(xué)發(fā)光TMA-6工作解決方案（一）及（b）于4℃保存1年他們兩個(gè)有9分鐘的孵育膜在TMA-6和5秒的曝光后得到。（A = 5000，B = 1000 PG PG，C = 180皮克，D = 30 PG，和E = 5 PG）（點(diǎn)擊放大）。

　　雖然與TMA-6溶液中測(cè)定的過(guò)氧化物酶的檢測(cè)提供了幾乎相當(dāng)于實(shí)現(xiàn)了與PS-阿托的靈敏度和工作范圍，更高的絕對(duì)光強(qiáng)度與PS-阿托對(duì)于一個(gè)給定的酶量有所放大的非特異性結(jié)合的影響印跡膜。這可以有效果，在某些情況下限制印跡檢測(cè)的靈敏度。此外，TMA-6所產(chǎn)生的光的強(qiáng)度較低，允許使用較高的底物濃度在工作試劑。這反過(guò)來(lái)，最大限度地減少擴(kuò)展孵化或暴露在高層次的結(jié)合酶底物耗盡。

　　膜基印跡檢測(cè)的檢測(cè)試劑可靠的比較是非常困難的。如在下面更詳細(xì)討論的，印跡膜，特別是由X射線膠片上的光密度，定量測(cè)量是不精確的。推斷的檢測(cè)試劑的影響?yīng)氉詮倪@種類型的測(cè)量需要謹(jǐn)慎。另一個(gè)困難是抗體數(shù)量和靈敏度明顯的阻塞條件的影響。這些參數(shù)必須在印跡法憑經(jīng)驗(yàn)優(yōu)化。哪些參數(shù)是最優(yōu)的出現(xiàn)依賴于檢測(cè)試劑的選擇，以及蛋白質(zhì)分析物和其他因素。任何打算檢測(cè)試劑進(jìn)行比較，然后，面對(duì)所有分析變量標(biāo)準(zhǔn)化，在這種情況下，一些測(cè)試將在非最佳條件下進(jìn)行，否則使用單獨(dú)優(yōu)化的條件下進(jìn)行技術(shù)上的不平等比較與選擇。

　　銘記這些注意事項(xiàng)，TMA-6，成立于ECL提前Amersham Biosciences公司W(wǎng)estern印跡檢測(cè)試劑盒，已經(jīng)比7兩個(gè)基于魯米諾試劑和試劑含有9,10 -二氫吖啶PS-3 Western blot檢測(cè)系統(tǒng)的性能。TMA-6檢測(cè)試劑所示，可提供優(yōu)越的背景信號(hào)，并檢測(cè)蛋白水平的降低比其他材料。每個(gè)試劑單獨(dú)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下使用。

　　過(guò)氧化物酶和結(jié)合物的高靈敏度地檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光試劑的市售了好幾年。在使用中的大多數(shù)試劑構(gòu)成增強(qiáng)魯米諾的檢測(cè)系統(tǒng)。例子包括Amersham公司的ECL，從皮爾斯生物技術(shù)公司（Rockford，伊利諾州）超級(jí)信號(hào)，Lumiglo從嘉里建設(shè)有限公司（馬里蘭州蓋瑟斯堡），以及羅氏和鄰臨床診斷試劑。物L(fēng)umigen PS-1，唯一先前nonluminol的過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑使用的9,10 -二氫吖啶酯化合物作為過(guò)氧化物酶底物。所有這些試劑都由其制造商提供的，作為兩個(gè)獨(dú)立的部件，必須在即將使用前進(jìn)行組合，以創(chuàng)造一個(gè)有效的解決方案。這兩個(gè)工作溶液中過(guò)早反應(yīng)的底物與過(guò)氧化氫 ??的混合試劑中的底物的水解不穩(wěn)定性的問(wèn)題，防止長(zhǎng)期貯存溶液。

　　一些商業(yè)化學(xué)發(fā)光過(guò)氧化物酶底物的工作方案規(guī)定的有用壽命進(jìn)行了調(diào)查。他們發(fā)現(xiàn)范圍從“幾個(gè)小時(shí)”24小時(shí)在室溫下。更穩(wěn)定的工作試劑解決方案提供了簡(jiǎn)化的自動(dòng)化分析的優(yōu)勢(shì)。

　　對(duì)PS-阿托和TMA-6基板的設(shè)計(jì)的早期發(fā)現(xiàn)，的化學(xué)發(fā)光AP襯底物L(fēng)umigen APS-5也經(jīng)歷了化學(xué)發(fā)光的過(guò)氧化物酶與過(guò)氧化氫 ??的催化反應(yīng)（參見(jiàn)圖10）。反應(yīng)的APS-5與提示這兩種酶產(chǎn)生強(qiáng)烈的化學(xué)發(fā)光。環(huán)外雙鍵化合物與更大的水解穩(wěn)定性一個(gè)硫基結(jié)果，在更換的磷酸基團(tuán)。

　　在這種結(jié)構(gòu)類超過(guò)50種不同的候選化合物已準(zhǔn)備和測(cè)試。選擇兩種化合物用于商業(yè)開(kāi)發(fā)解決方案的分析和固相分析TMA-6，PS-阿托，在結(jié)構(gòu)上非常相似，但有微妙的不同性能。令人滿意的水溶性的烷基磺酸取代基，每個(gè)分子中內(nèi)置憑借保留。朝向過(guò)氧化物酶的酶促活性被保留，為的是達(dá)到最大光強(qiáng)度的速度，。得顯著，未觀察到過(guò)氧化氫在襯底中的乙烯基硫醚基團(tuán)的非酶自氧化，即使在最后的工作溶液。

　　PS-阿托和TMA-6，評(píng)估通過(guò)監(jiān)視它們的任何變化后的存儲(chǔ)期間的化學(xué)發(fā)光峰值強(qiáng)度，工作溶液的試劑的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于其它試劑在使用。只要為3個(gè)??星期，兩個(gè)試劑的工作溶液，在室溫下穩(wěn)定。解決方案可以在4℃下儲(chǔ)存，??并使用幾個(gè)月，如在圖7中示出。結(jié)果控制通過(guò)比較新鮮配制的工作液。含過(guò)氧化物酶底物的組分溶液表現(xiàn)出甚至更長(zhǎng)的貯存穩(wěn)定性。沒(méi)有可檢測(cè)到5個(gè)月后，在40℃或1年??，在室溫下在溶液中測(cè)定的性能退化的發(fā)生。這種程度的水解穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)所有其他商業(yè)的化學(xué)發(fā)光過(guò)氧化物基板。

　　用于可視化固定化的酶標(biāo)記抗體的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑不一定必須符合相同的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)的貯存穩(wěn)定性，例如，試劑在船上使用一個(gè)自動(dòng)免疫分析儀必須。由于精度分析很少印跡技術(shù)正式評(píng)估，測(cè)量往往是最好看作是半定量。按鍵實(shí)驗(yàn)變量是很難控制的抗體的質(zhì)量，膜性能，阻塞協(xié)議和綁定協(xié)議。此外，X射線膠片圖??像的光密度分析不能檢測(cè)在二維光強(qiáng)度圖案的細(xì)微的差別。（現(xiàn)代CCD相機(jī)成像系統(tǒng)，但是，改進(jìn)的能力有些印跡分析。）

　　由于這些原因的檢測(cè)試劑的質(zhì)量隨著時(shí)間的推移，微小的變化不會(huì)導(dǎo)致可測(cè)量的衰減印跡檢測(cè)性能。TMA-6存儲(chǔ)的質(zhì)量的評(píng)估工作溶液中的官能印跡測(cè)定形式，在結(jié)果沒(méi)有差異，得到即使在溶液中，使用可以在更嚴(yán)格的，儀器為基礎(chǔ)的解決方案測(cè)定中看出一些性能劣化。TMA-6存儲(chǔ)長(zhǎng)達(dá)一年的工作方案，在4°C，使用前涂抹檢測(cè)的蛋白質(zhì)，從而是可以接受的做法。

　　結(jié)論P(yáng)S-阿托是第一化學(xué)發(fā)光的過(guò)氧化物酶底物，提供了能夠被存儲(chǔ)為一個(gè)瓶使用的試劑。在4℃下穩(wěn)定性的測(cè)試沒(méi)有發(fā)現(xiàn)存儲(chǔ)的工作溶液，在室溫下或4個(gè)月?3周的試劑的性能惡化此外，過(guò)氧化物酶底物本身是穩(wěn)定的，在室溫下了數(shù)個(gè)月。工作溶液的擴(kuò)展的貯存穩(wěn)定性允許一個(gè)單一的容器內(nèi)的試劑，可以采用過(guò)氧化物酶的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。除了這種方便的明顯的好處，PS-阿托可以使用，而不需要額外的泵送和混合裝置將自動(dòng)分析儀器。它能夠允許的極端敏感性過(guò)氧化物酶檢測(cè)定量過(guò)氧化物濃度超過(guò)四個(gè)日志，檢出限10 zmol在6分鐘檢測(cè)在保守估計(jì)。

　　TMA-6，印跡應(yīng)用中使用，如Western印跡法，開(kāi)??發(fā)股份PS-阿托在快速信號(hào)的產(chǎn)生和試劑的穩(wěn)定性方面的優(yōu)點(diǎn)。它允許基于膜的印跡檢測(cè)的高靈敏度檢測(cè)。成像參數(shù)的優(yōu)化，以提供足夠的時(shí)間，信號(hào)的持續(xù)時(shí)間被延長(zhǎng)的典型的印跡膜。

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　　哈希姆，博士，AKHAVAN Tafti的是副總裁兼首席科學(xué)官，謝文化，哲學(xué)博士，和雷努卡DeSilva酒店，博士，研究的科學(xué)家威廉·G·克里普斯和羅伯特A. Eickholt是研究化學(xué)家理查德·漢德利博士，主任知識(shí)產(chǎn)權(quán)朗達(dá)·林斯基和邁克爾·Mazelis是研究化學(xué)家A.保羅Schaap博士，物L(fēng)umigen公司（密西根州Southfield）的總裁。

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